用立体显微镜更有效地研究发育生物学:斑马鱼，青鳉和爪蟾

上面提到的三种水生模式生物，斑马鱼，青鳉，和非洲爪蟾，通常用于分子和发育生物学。下图是一条成年斑马鱼。

在分子生物学和发育生物学中，这些水生脊椎动物模式生物被广泛应用于研究发育的分子过程和作为疾病模型。为了研究这些分子机制，研究人员在细胞或亚细胞水平上用荧光标记并在发育中的生物体中观察数小时或数天的蛋白质［4］．

这里描述的可容易培养，并保持在实验室所有三种模式生物，具有短的生命周期，以及经得起用于遗传修饰。这些修饰的实例是一个基因（敲除）或引入的基因（敲入）的删除。如果外源基因导入到基因组中，其结果是所谓的转基因生物体。下面，我们将专注于这个方法[5]．

此外，斑马鱼有一个特殊的特性，这也使它们对发育神经科学有用:斑马鱼的幼虫是半透明的，因此可以在发育期间同时测量多个神经元的活动[6]．

在对水生模式生物（如斑马鱼）进行常规工作时，有三个常见步骤：

• 转基因
• 荧光检测
• 功能成像。

以下章节对每个工作步骤进行了更详细的描述。每个步骤都需要高效可靠的显微镜检查。本报告中将此步骤顺序称为“工作流程”。

大多数国家对用于科学实验的动物安全都有明确的规定，瑞士也有这样的规定[7]．遵守这些规定，有利于高效、快速筛选转基因胚胎和对产生胚胎的成年斑马鱼进行快速加工。

作为单独的成年斑马鱼不能永久标记，至少不能在当前时刻，男性和女性是杂种，以评估它们的胚胎而筛选转基因，需要被保持在单独的储存罐，直到它们的胚很好的特点。更快的胚胎的性状可以被确定：

• 越早将成虫放回合适的容器中
• 在工厂各个坦克的数量和工作的人员的数量，可以最小化
• 而且，只有具有理想性状的斑马鱼才会被保留下来，从而避免了为实验工作保留不必要的大量鱼类的需要。

对斑马鱼胚胎进行更快、更准确的表征，就会产生一种更有效、更经济的方式来维持这些模型生物。

快速准确地鉴定胚胎有两个关键因素：

• 有时昏暗的发光转基因的高效荧光检测
• 以及一种高效、方便的胚胎成像筛查方法。

在实际应用中，检测微弱的荧光信号，使他们肉眼可见的以简单的方式荧光显微镜是最佳的工具来实现这一目标。

转基因

在斑马鱼中，青鳉和爪蟾的遗传修饰的DNA，RNA，或染料的显微注射典型地进行（作为质粒，的mRNA，吗啉代中，siRNA等）[8]．这些操作是有效的支持光学放大率可实现的立体显微镜，如徕卡M50，徕卡M60，或徕卡M80[9]。如果将DNA注射到细胞中并整合到基因组中（转基因），则会产生转基因动物。

荧光筛查

作为生物体发育成幼虫阶段，成功整合（到基因组中）和转基因的表达进行评估。转基因的一部分，通常为荧光蛋白的基因，如绿色，红色或黄色荧光蛋白[10]．因此，筛选潜在转基因幼虫通常使用荧光立体显微镜，如徕卡MZ10 F［11］、徕卡M165 FC或徕卡M205 FA［12]．

功能性成像

功能成像的一个例子是通过Ca进行电生理研究^2＋在多种类型的细胞信号传导。用合成的Ca生物体的注射^2＋指标[13]，经常使用微操作器，可以研究神经元和胶质细胞的神经元活动。由于发育中的斑马鱼幼虫具有半透明的特性，钙指标也可以在完整或半完整的生物体中进行基因表达和成像。这些实验经常使用多光子荧光显微镜[14]．

在发育过程中，通常用立体显微镜对生物体进行成像，在某些情况下，还用它进行进一步实验的操作和准备。当只需要一个2D视图时，使用一个宏观视图(如徕卡Z6)进行成像7月和徕卡Z167月［１５］．高分辨率观察转基因xfp表达(同时有三个或更多荧光蛋白)[16]生物或免疫染色制剂，macroscopes或共焦，多光子，和lightsheet显微镜，如徕卡TCSSP8系列[17]，是常用的。

斑马鱼实验室（Mosimann实验室，IMLS）的照片显示了几台立体显微镜。

转基因

在进行转基因研究时，重要的是利用透射光基来形象化卵子的内部结构。由于需要注射许多卵子，才能获得几个“奠基者”，使转基因成功地融入到种系中，因此注射通常需要几个小时，这使得放松的工作姿势非常重要。在注射步骤中，重要的是在显微镜下排列鸡蛋，以便操作人员有一个良好的概述，使他/她以快速和有效的方式注射。最后，一个大型显微镜基座使研究人员能够在几个盘子周围移动，降低它们从边缘掉下去的风险。典型的微操作器，比如徕卡机械手[18]使用的是Eppendorf InjectMan NI 2或Narishige MMO-220A。常用的喷油器有ASI MPPI-3、Eppendorf FemtoJet和Parker Picospritzer等。

• 更大的视场(FOV) /物体视场(of)(观看区域)→视场数(FN)为23的目镜，与FN为21或更小的目镜相比，视场数(FN)为23的目镜视野增加20%或更多;
• 观察样品时所需聚焦更少→在低放大率下大景深;
• 徕卡M80的最大分辨率为1.6 μm(数值孔径(NA)为0.21)，徕卡M60和徕卡M50的最大分辨率为2.2 μm (NA 0.15);
• 具有消色差或平面消色差物镜的高质量图像[21]；
• 紧凑的设计→小型脚印尺寸允许显微镜装配到一个有限的空间;
• 提高舒适度和生产效率：使用扭矩可调的聚焦驱动时，肌肉张力更小→ 根据显微镜系统的总重量，聚焦旋钮的扭矩可以根据用户的喜好进行调整；
• 避免Ergo模块的疲劳→让用户在工作时保持更好的姿势;
• 仪器的整体设置干净紧凑→ 电缆集成到聚焦柱中，用于摄像头、照明和电动聚焦。

• 多种对比方法：亮场和单面暗场照明；
• 在进行操作、分类和解剖时，可以轻松地移动多个标本/样本，并在目标周围留出更多的空间→ 用于放置试样的大平面；
• 操作简单，非常适合日常应用。

• 多功能对比方法：非常均匀的明场，优化Rottermann对比度和低反射暗场;
• 操作简单，工作速度快，节省时间-自动光圈自动调整到变焦光学，以实现最佳对比度;
• 用高精度研究整个生物 - 大型视野（FOV）直径多达65毫米;
• 在标本和手柄上工作更容易，无疲劳-极平，符合人体工程学的LED灯座;
• 由于使用徕卡应用程序套件进行完全编码，因此具有再现性(拉斯维加斯） 和拉斯维加斯X软件［22］；
• 明亮、均匀且颜色中性的照明，不受强度影响–采用最新的LED技术。

虽然生物工程的荧光蛋白已经产生了几个增强绿色荧光蛋白变异体，所需要的转基因可能在低水平表达。这种低水平的表达可能是由于生物过程和技术问题。由于这些原因，荧光检测的灵敏度可以决定是否找到正确表达转基因的转基因生物。此外，如上所述，对转基因弱信号进行高效的荧光检测对于高效、准确地表征斑马鱼胚胎性状非常重要。

在筛选和鉴定发育中的斑马鱼时，经常需要比较具有相同照明和显微镜光学设置的生物。因此，为了方便、有效地回忆和确保重现性，存储这些设置是至关重要的。在单独观察时，转基因斑马鱼的荧光模式可能非常抽象，了解这种荧光模式通常需要在荧光和碱基的透射光之间进行切换。编程的显微镜控制器，如徕卡的SmartTouch或脚踏板，并与编码显微镜与透射光基，如徕卡的M165 FC或徕卡的M205 FA与徕卡的TL5000 Ergo，大大简化了这项任务。它还可以在荧光成像后快速评估细胞位置和胚胎方向。

当在实验过程中观察非常微弱的荧光信号，它以消除或最小化，尽可能背景自发荧光从在其中将动物成像的容器的材料，通常的培养皿来是很重要的。涉及多个供应商获得了广泛的搜索后，莫西曼实验室发现的塑料培养皿中以最小的自发荧光，足够的硬质塑料，以及关闭盖子，和有利的价格。用一种特殊的方法，这些培养皿为他们预备的结合实验观察期间，以消除污染导致最小的背景自发荧光。这些培养皿更多细节可以从莫西曼实验室获得［4］．

徕卡M125［23］带荧光模块的立体显微镜（徕卡EL6000）［24］外部荧光源)或徕卡MZ10 F［11］荧光立体显微镜与徕卡TL3000 ST［２０］透射光基地：

徕卡MZ10 F增加工作效率

• 优异的分辨率(最大1.33 μm)，高数值孔径(最大NA = 0.25)和10:1变焦范围;
• 采用TripleBeam技术的强荧光照明和最高荧光信噪比（S/N）［25］；
• 高质量的图像与计划消色差和计划复色差物镜[21]；
• 快速四位过滤器更换系统（FLUOIII）；
• 广泛的标准和定制过滤器几乎任何荧光技术;
• 用户防范紫外线辐射;
• 各种各样的目标和附件可用

徕卡M165 FC荧光立体显微镜(中程)与徕卡TL4000 RC/RCI透射光基和M205 FA［12]荧光立体显微镜（高端）与徕卡TL4000 RC / RCI或莱卡TL5000人体工程学［２０］．

• 从概述到最好的细节与变焦光学放大范围16.5:1或20.5:1;
• 与TripleBeam最高荧光信号噪声（S / N）比［25］技术;
• 徕卡M165 FC的分辨率降至1.10μm（最大NA 0.3），徕卡M205 FA的分辨率降至0.96μm（最大NA 0.w35）；
• 实现最高的分辨率和景深，目前可能的3D图像查看立体显微镜→FusionOptics[26]可选配徕卡M205 FA;
• 具有平面消色差或平面复消色差物镜的高质量图像[21]；
• 由于仪器编码，容易获得可重复的结果；
• 用徕卡PLAN对浸没或嵌入的试样进行无变形观察7月2.0x CORR物镜，可消除折射率失配[27]；
• 使用全自动徕卡M205 FA进行复杂实验时，完全舒适和易于使用;
• 快速四位过滤器更换系统（FLUOIII）；
• 广泛的标准和定制过滤器几乎任何荧光技术;
• 各种各样的目标和附件可用。

功能成像通常涉及神经活动的电生理学研究，实验利用Ca^2＋发出信号，或解剖有机体。由于斑马鱼幼虫的半透明特性，这些类型的实验通常使用多光子荧光显微镜进行(6、14)或共聚焦显微镜[17]．解剖，成像经常与立体显微镜来完成。功能成像的一些例子如下所示。

斑马鱼(鲐鱼类)［1］，美达卡鱼(Oryzias latipes)［2］，以及非洲爪蛙（非洲爪蟾）［3］是通常用于发育生物学研究的水生模式生物。

斑马鱼、青鳉鱼或非洲爪蛙的常规工作流程涉及使用立体显微镜的多个步骤:

• 转基因，将DNA注射到生物体的卵子中以产生“创始人”;
• 荧光筛选，观察幼虫正确的转基因表达，寻找“奠基者”
• 功能成像，具有较低或较高分辨率显微镜表征稳定的转基因系，或研究电生理和神经元活动。

转基因通常用立体显微镜进行，转基因株系用荧光立体显微镜进行表征。为了获得更高分辨率的亚细胞细节，电生理学或神经元活动，共聚焦或复合显微镜被使用。

本报告引用了科学家和技术人员使用水生模型生物的例子，并展示了使用大范围显微镜和附件的不同可能设置。由于每个实验室的需求可能有很大的差异，因此可以使用大范围的配置和仪器来解决工作流中的特定任务，甚至可以使用一个仪器来执行更多的工作步骤。这份简短的报告提出了基于不同实验室经验的推荐工作流程，可以作为一个非常有用的参考或指南，当建立或扩大一个发育生物学实验室使用斑马鱼，medaka鱼，或小非洲爪蛙。

1. 达尼奥·雷里奥，网页:www.FishBase.org
2. Oryzias latipes，网址:www.FishBase.org
3. 非洲爪蟾，网址：www.两栖动物网
4. 瑞士苏黎世大学分子生命科学研究所Mosimann实验室
5. 模式生物，维基百科，注意，特别参考本页列出的斑马鱼和爪蟾的参考文献85-87
6. Borlinghaus RT:神经科学和显微镜:一个有益的伙伴关系，网页:科学实验室
7. 动物实验，瑞士联邦食品安全和兽医局(FSVO)，网址:www.blv.admin.ch
8. DNA,维基百科；RNA，维基百科
9. 宣传册，徕卡M50，M60，M80
10. 荧光蛋白-介绍和光谱特性，网页:科学实验室
11. 徕卡MZ10 F
12. 小册子，徕卡M165 FC，M205 FA
13. 钙成像，维基百科
14. Pfeifer A:深层组织成像的多光子显微镜原理，网页:科学实验室
15. 小册子，徕卡Z6 APO, Z16 APO
16. Livet J，Weissman TA，Kang H，Draft RW，Lu J，Bennis RA，Sanes JR和Lichtman JW：神经系统荧光蛋白组合表达的转基因策略，网址：www.nature.com，nature 450:56-62（2007年11月）
17. 徕卡TCS SP8产品页面
18. 徕卡显微操纵器产品页
19. 小册子，徕卡S8 APO
20. 小册子，徕卡TL3000，TL4000，TL5000
21. 客观类，徕卡产品页面
22. 宣传册，徕卡LAS X软件
23. 小册子，徕卡M125，M165 C，M205空调
24. 徕卡EL 6000产品页面
25. Fuchs B：采用TripleBeam技术的立体显微镜荧光显微镜中提高信噪比的第三种照明路径，weblink：科学实验室
26. Goeggel D, Schué A和Kiper D: FusionOptics -结合高分辨率和景深的理想3D光学图像，网页:科学实验室
27. DeRose JA, Bürgers H:如何通过使用正确的物镜消除液体浸没或埋入样品的折射率不匹配来纠正立体显微镜中的像差，网页:科学实验室