集成调制对比(IMC)

调制造影剂是宽视场显微镜中的一种对比度增强方法，它将未染色标本和活细胞中的光学梯度或斜率转换为不同的光强度。它是由罗伯特·霍夫曼在1975年发明的，使用狭缝板来实现斜照明，并使用调制器来调节光强。由于标本的三维外观，调制造影剂在医学和生命科学中的主要应用是微操作技术，如IVF中的ICSI(胞浆内精子注射)和转基因中的克隆和原核注射。

细胞的许多成分由于其固有特性而引起透射光相位的变化。这些性质可能是特定结构的斜率和陡度，一种改变折射率变化率的结构或简单地改变给定结构的厚度。由于这些特性(例如电池厚度)通常在一定区域内逐渐变化(而不是立即变化)，因此在该区域上光的相位变化也是逐渐发生的，从而产生相位梯度。相位梯度会使入射光发生衍射，从而引起光的偏转角的变化。

由于调制对比采用的是斜照明，偏转角的变化可能会受到很大的影响，与无偏转光相比，光在不同的区域通过调制器。在生成的图像中，在坡度、陡度、厚度等方面或多或少都相同的单元格区域将以灰色显示。对于图像的背景也是如此，因为通过这些均匀区域的光不会由于样品中的相位梯度而经历相移，并且几乎不会偏转。

在调制对比系统中，无偏转光通过调制器中15%光允许的区域，导致细胞和背景的均匀区域呈灰色。当光通过导致相移(例如细胞膜斜率的变化)的样品区域时，光被偏转到调制器的暗区(1%许可)或透明区(100%许可)。当样品被斜照射时，图像将从梯度的一侧(其中光线在1%的许可下偏转到区域)显示较暗，而从梯度的另一侧(其中光线在100%的许可下偏转到区域)显示较亮。

在集成调制对比度(IMC)的情况下，调制器集成在物镜外的一个焦平面上，与光束路径中的聚光镜(中间瞳孔)共轭(图4)。调制器安装在插入支架一侧瞳孔间接口的滑块上(图5)。因此，它们可以自由获取，并允许用户根据需要轻松调整对比度。除此之外，还可以使用不同传输的调制器。滑块还具有未调制图像的亮场位置。已设置带有IMC的显微镜，以确保所有物镜的对比方向(3D印象的阴影方向)是相同的。因此，当改变物镜或放大倍数时，试样的空间印象保持不变，因此不需要调整狭缝隔膜。

当解耦调制器时，一个基本的考虑是，物镜的后焦平面可以在整个45毫米单焦距离范围内的任何地方。因此，物镜外的调制器必须至少可移动该距离。由于徕卡物镜的设计，由固定焦平面定义，部署在倒置显微镜和从5倍到63倍的固定放大步骤，有可能将调制平面的数量减少到两个瞳孔位置(图6)。

光束到瞳孔图像的路径，即所谓的中间瞳孔，被设计成一个1倍望远镜系统。物镜后面的无限光束路径在中间瞳孔中再现。因此，任何厚度的平面平行光调制器也可以插入到中间瞳孔处的光束路径中，倾斜或不倾斜，而不损害图像的位置或质量。杂散光和假光通过望远镜系统的最佳单色和色度校正以及IMC调制器的蒸汽沉积灰色和黑色金属涂层的极低反射特性最小化。

IMC为调制对比度的个人调整提供了大量的余地。调制器是可调的垂直提供一个均匀的图像在任何时候。不同的阶段或缓冲溶液水平和不同的位置的细胞在标本盘因此可以补偿。向侧面移动调制器会改变分辨率:调制器和狭缝隔膜向外移动得越远，分辨率就越高。分辨率Res = λ\2NA)。

两个调制器参数影响对比度的强度:传输和灰色区域的宽度。减少透射能增加对比度。例如，25%的透射率可以产生平滑的对比。当数值为10%左右时，对比度会明显变得清晰。改变调制器宽度同样有效(图7)。

缩小灰色区域的结果在清晰的对比，而宽调制器软化整体图像印象。IMC的狭缝隔膜具有两个开口。第一狭缝成像在调制器的灰色区域上，产生调制对比度的斜照明。第二个狭缝被偏振箔覆盖(图7)。位于膜片前面的可旋转偏振器可以增加或减少调制对比度的3D效果。当使用塑料盘子工作时，偏光器不会影响图像质量，因为光只在照明侧偏光，而在物镜侧不使用分析仪。狭缝隔膜的尺寸与最常用的冷凝器相匹配。

因此，IMC不仅适用于生物材料的常规检查，也是微操作、微注射或微解剖等高要求应用的绝佳工具。

综合调制造影剂的诸多优点使其在宽视场显微镜中得到广泛应用。集成调制对比允许使用放大率高达63X的物镜。不需要特殊的物镜，高校正物镜(如平消色差物镜和复消色差物镜)可用于调制对比。这就产生了具有良好对比度和可视性的优秀细节分辨率

调制对比显微镜的另一个优点是，与差分干涉对比显微镜不同，可以使用塑料容器和盘子，因为光路中的偏振器位于样品之前。此外，不需要沃拉斯顿棱镜。这使得配备调制造影剂的显微镜成本适中。

霍夫曼，R.:调制对比显微镜:原理和性能，显微杂志，110卷，第3页，1977年8月，第205-222页