材料 - 实验室库存
徕卡LMD系统
- 低温恒温器（例如Leica Cm1850紫外线）
- 管液管10-1,000μl.
- 管液2-20μl.
- 离心机的管
- 镊子
- 低温恒温器用镊子和刷子
材料 - 化学品和耗材
Qiagen RNeasy Micro试剂盒
- 一包50毫升的猎鹰管
- 纯乙醇(乙醇)，分子生物学级
- 分子生物学级水
- 甲苯基紫
- 铝箔
- 0.5或0.2 ml薄壁PCR管与平盖适合LMD阶段收藏夹
- 移液尖端（1 ml移液管和20μL移液管）
- 带无菌过滤嘴的注射器
- 冰
- 冷冻机的刀片
- parafilm.
- 徕卡LMD幻灯片（例如4μm笔框架）
- 二氧化硅包
- 金貂
上游准备
1 %甲酚紫(CV)溶液100%乙醇(EtOH):将500mg甲酚紫粉加入50ml Falcon管中，加入100%乙醇填充50ml。使用前1周准备。将“猎鹰”放入冰箱，用铝箔(甲酚紫对光敏感)覆盖，每天轻轻摇晃。
Etoh Row用于固定和洗涤步骤：
- 2 × 75%乙醇:将37.5 ml乙醇注入50ml Falcon管中，加入分子生物学级水至50ml
- 将一个75％Etoh Falcon放入-20°C冰箱中
- 95 EtOH 47.5 ml EtOH加入50ml Falcon管，加入分子生物学级水至50ml
- 将100％EtOH 50mL EtOH成50ml Falcon管
- Falcon管中的乙醇排可以（重新）最多3天。
重要的提示：
- 用Parafilm密封猎鹰储存→这将防止Etoh蒸发！
- 地方LMD在水下滑行10分钟紫外线-C灯→激活膜，以便更好地粘附并灭菌表面！
- 将0.2或0.5毫升管在盖子下打开紫外线-c光至少30分钟→灭菌并消除任何RNA和RNase！
- 准备三个50毫升的猎鹰管与一些硅袋在圆锥→硅将保持幻灯片和切片干燥，与RNA工作意味着湿度和湿气是你的敌人，因为他们可以激活RNases!
冷冻乳冻结
将冷冻压力放入Leica Ludostat，直接从-80°C放置，使其在-19°C下平衡至少30分钟。
在平衡准备部分的合适厚度（厚度应根据感兴趣的细胞的直径选择，为该测试制备10μm部分）。
将一个（卷曲的）部分直接从低温切成0.5ml管，并立即加入350μlrlt缓冲液（Qiagen Micro rneasy套件的含量）。这将作为质量和数量的积极控制。
图4：用冷镊子收集的卷曲部分，直接转移到无菌管帽。立即添加350μLRLT缓冲液以保护RNA免于降解。
图5：剖面准备和安装在笔框架上。冷冻部分将容易地熔化到来自室温的膜。
将载玻片与截面放入氨基氨基中，在-20°C下用75％EtOH溶液进行2分钟（简要固定）。2分钟后短暂空气干燥滑动并将其存放在50毫升猎鹰中，用圆锥有一些硅胶袋（保持干燥）。
用另一个部分和滑动重复此安装，但代替储存通过无菌过滤器尖端使用注射器添加一些1％冠圆液溶液。将染色溶液留在部分上1分钟。然后，通过将滑块简单地浸入75％EtOH，然后95％EtOH和最后100％EtOH来洗掉酸乙烯基紫。简短地将载玻片滑，并将其存放在50毫升的猎猎场中，伴有一些硅胶袋（保持干燥）。
用另一个部分重复整个过程并幻灯片。
图6:甲酚紫用注射器通过无菌过滤器覆盖载玻片切片1分钟。
图7：染色后的清洗步骤:将载玻片浸入上升的乙氧基行，洗去残留的甲酚紫。
重要的提示：
- 将载玻片储存在Falcon管中，并在圆锥处放置一些硅袋，用Parafilm密封，硅将保持载玻片和切片干燥，密封防止环境潮湿!
把所有的管子和猎鹰和滑梯放在冰上。让载玻片在室温下平衡15分钟LMD在使用前密封猎鹰的系统。
LMD测试幻灯片
你现在应该有：
- RLT - 350µl缓冲液(阳性对照)
- 安装在滑块上的一部分，并用硅袋储存在50毫升猎鹰中的EtOH固定
- 2个载片，切片用EtOH固定，CV染色，存储在一个50毫升Falcon与硅袋
图。图8：缓冲液，管，猎鹰中的载玻片和冰冷冰箱的75％EtOH。
带有未染色部分的幻灯片用作另一个控件。因此，直接用RLT缓冲液将其从膜上消化，并转移到0.5 ml的试管中(RLT缓冲液总量必须为350µl，不要全部用于从载玻片上消化，因为它会冲洗掉载玻片!)
其中一个固定和染色的载玻片用作另一个控制。因此，用RLT缓冲液直接从膜中消化部分并将其转移到0.5ml管中（RLT缓冲液的总量必须为350μL，不要使用所有物质从滑动夹上消解，因为它将在滑动中冲洗载玻片！）。
用于RNA分析的Leica LMD系统
其余固定染色的载玻片适用LMD．因此，将载玻片装入样品夹中，并在采集夹中装入0.5 ml管。选择受载集热器的位置，并在整个截面上用标记进行解剖LMD软件，使用所需的放大倍数。启动激光，解剖后检查所有的切片都已收集在收集管中。如果有必要，可以使用Move+Cut重新切割该节，以确保收集所有的节。
卸下收集管，小心地关闭盖子并简要旋转解剖。打开盖子并加入350μLrlt缓冲液（最多65μlrlt缓冲液在切割之前可以添加到收集帽中）。
图9:带有固定染色切片的PEN框架载片LMD系统。
装载另一个集合盖，并将空膜靠近收集部分的区域（大致相同的区域大小为μm²）。卸下收集管，小心地关闭盖子并简要旋转解剖。打开盖子并加入350μLrlt缓冲液（最多65μlrlt缓冲液在切割之前可以添加到收集帽中）。该管将作为一个LMD消极控制。
图。图10：将切片以所选择的倍率分解成无菌管帽。
图11:清晰可见标记区域及解剖结果:左侧为切割线，中心为解剖区，右侧为收集管帽内的解剖区。
重要的提示：
- 最多65μlrlt缓冲液可以直接施加到收集管帽上，以保护解剖含量直接在捕获后免于降解
图12:在低倍镜下采集的解剖图也可以用肉眼看到(使用5倍物镜完成的解剖例子)。
激光显微切割下游的制备和加工
- 使用RPE将44毫升添加到瓶子上，然后选中复选框以确保添加ETOH。
- 制备70％EtOH的溶液：将35ml 100％EtOH加入50ml缩斗，加入15ml分子生物级水。
- 制备80％EtOH的溶液：将40ml 100％EtOH加入50ml缩斗中，加入10ml分子生物级水。
图13：使用QIAGENRNEAY的RNA提取的轻微修饰方案®使用微套件。
用QIAGEN MICRO KIT提取RNA，具有以下略微改性方案：
- 让所有管准备好。
- 将350μL70％EtOH加入每个管（如有必要，在加入350μL70％EtOH之前转移到另一管中，小心地与液管混合并直接转移到红色旋转柱。
重要的提示：
350μL应分成100和250μL，以免超过0.5ml管的体积。混合可以直接在柱上完成。
- 旋转15秒，以10,000 rpm。
图14:缓冲应用于Qiagen RNeasy®旋转柱。
- 弃用流道，加入350µl RW1清洗柱
- 旋转15秒，以10,000 rpm。
图15：准备好的离心机中的列。
- 丢弃流通，将柱子放入新鲜的2mL管中，并加入500μlrpe（前oh）以洗涤柱
- 旋转15秒，以10,000 rpm。
- 弃用洗脱液，加入500µl 80%乙醇洗柱
- 旋转2分钟，13,000 rpm
- 丢弃流动并将柱子放入新鲜的2毫升管
- 最大5分钟。速度和盖子打开以干燥柱的硅胶膜
- 在14μl水中洗脱：小心地将14μlrnase的水浸入塔膜的中间，并将柱子放入新鲜并标记的1.5ml管中
图16:将14µl无RNA酶的水轻轻滴入柱中部洗脱提取的RNA。
- 旋转1分钟，13,000 rpm
- 小心地将流入流返回到柱膜的中间
- 旋转2分钟，13,000 rpm
洗脱液应储存在-80°C，或者如果可能的立即用于评估质量和数量。
短暂的协议摘要
样品:
A - 样品直接从Cryo（总体阳性控制）挑选
B - 样品固定，用液管挑选（阳性控制，EtOH固定的效果）
C - 样品固定并染色，用液管挑选（阳性控制，EtOH固定和染色的效果）
D样固定染色，用LMD（效果LMD）
在样品旁边收集的E - 空膜（阴性控制LMD过程/污染)
F - RLT缓冲液负控制下游净化
用Qiagen Micro Kit提取RNA：
- 添加350μlrlt缓冲液
- 加入350μL70％EtOH，用液管混合并直接转移到柱子
- 旋转15秒，每分钟10,000转
- 用350µl RW1冲洗弃液
- 旋转15秒，每分钟10,000转
- 用500µl RPE(之前添加EtOH)洗去流过液
- 旋转15秒，每分钟10,000转
- 用500µl 80%乙醇液清洗
- 旋转2分钟，每分钟10,000转
- 丢弃流动
- 旋转2分钟，最大。速度与lid打开干膜
- 用14µl水*洗脱
- 旋转1分钟，全速
- 使用洗脱液并将其放回柱中
- 旋转1分钟，全速
结果
| 好吧 | RIN® | 28s / 18s. （高度） |
28s / 18s. （区域） |
浓缩的。 (ng /µl) |
样本 描述 |
警报 | 观察 | 总RNA区域 | 核糖体rna区域 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A0 | - | - | - | 137. | 梯子 | - | - | ||
| A1 | 7.4 | 1.4 | 1.9 | 69.1. | 一种 | 2.79 | 0.61 | ||
| B1 | 7.1. | 1.3 | 1.9 | 84.5 | B. | 3.41 | 0.76 | ||
| C1. | 7.3 | 1.4 | 2.0 | 127. | C | 5.13 | 1．26 | ||
| D1 | 7.2 | 1.0 | 2.0 | 83.6 | D. | 3.38 | 0.78 | ||
| E1. | 6.5 | 0.4 | 0.4 | 110. | E. | 4.44 | 0.98 | ||
| D9. | 6.9 | 0.7 | 0.9 | 67.3. | D. | 2.68 | 0.59 | ||
| C2. | - | - | - | 7.36 | K. | ！！ | RNA浓度外面的rine推荐范围 | 0.30 | - |
| D2 | - | - | - | 6.57 | L. | ！！ | RNA浓度外面的rine推荐范围 | 0.27 | - |
| 样本名称 | 材料 | 日期 | 时间 | A260浓度（NG / UL） | A260(10毫米) | A280(10毫米) | A260 / A280 | A260 / A230 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Blank_6. | RNA. | 11.12.2014 | ###### | 0. | 0. | 0. | - | - |
| 一种 | RNA. | 11.12.2014 | ###### | 32.42 | 0.81 | 0.41 | 1.98 | 0.13 |
| B. | RNA. | 11.12.2014 | ###### | 48.18 | 1.2 | 0.58 | 2.07 | 0.1 |
| C | RNA. | 11.12.2014 | ###### | 71.01 | 1.78 | 0.89 | 2 | 1.51 |
| D. | RNA. | 11.12.2014 | ###### | 48.32 | 1．21 | 0.54 | 2.24 | 0.03 |
| E. | RNA. | 11.12.2014 | ###### | 64.65 | 1.62 | 0.73 | 2.2 | 0.06 |
| D. | RNA. | 10.12.2014 | ###### | 41.79 | 1.04 | 0.47 | 2.23 | 0.03 |
| K. | RNA. | 11.12.2014 | ###### | 1.72 | 0.04 | 0.02 | 1.97 | 0.02 |
| L. | RNA. | 11.12.2014 | ###### | 0.74 | 0.02 | 0.01 | 2.91 | 0.02 |
质量
具有不同治疗的所有样品（A-D）具有几乎相同的质量（RIN 7.1-7.4）。对EtOH固定，染色和徕卡没有影响LMD解剖检测。
在Parafilm密封的50mL猎鹰管中的载玻片在-80℃下储存过夜，在-20°C冷冻机中轻轻地解冻20分钟，在4°C冰箱中20分钟，在室温下15分钟重新打开猎鹰管导致徕卡后的可比结果LMD解剖（样品E1＆D9，RIN 6.9和6.5）。
所有阴性对照都是空的。
数量
具有不同处理的所有样品（A-D）几乎相同，仅量C（固定，直接从载玻片染色并拾取）显示出比阳性对照（样品A）的量更高。没有EtOH固定，染色或徕卡的影响LMD解剖检测。
在-80°C的Parafilm密封的50mL猎鹰管中的冰储存过夜，在-20°C冷冻机中轻轻地解冻20分钟，在4°C冰箱中20分钟，在室温下15分钟重新打开猎鹰管导致徕卡后的可比结果LMD解剖同样（样品E1和D9，储存后的量略高）。
所有阴性对照都是空的。
不同的测量方法导致不同的结果→常见的测量误差。
综上所述，这些数据清楚地表明，工作流程并不影响RNA的质量和数量。
承认
我想要感谢Randolph-Habecker博士主办的LMD作坊。
