相衬

相对于通过样品，导致光的相移。因为只有幅度移位（强度差异）对于人眼或照片探测器可见，所以样本的染色将介导幅度偏移和通过通过的光强度的差异。然而，许多染色试剂对活细胞有毒。相位对比度显微镜提供了使用光路长度差异引起的相移的可能性，以使样品下方可见光学显微镜。它通过所得到的光波的干扰改变相移到幅度变化。

相差显微镜技术是在20世纪30年代由荷兰物理学家Frits Zernike发明的。1942年这项技术投入使用后，泽尼克于1953年获得诺贝尔物理学奖。

光程长度是折射率和光程中两点之间的厚度的乘积。它与穿越时间和光的速度有关。光程长度的不同导致了光波通过样品时的不同速度(即相移)。结果就会出现相的差异。与周围介质相比，较高的折射率会导致光波的减速和相位延迟。

干涉描述了两种波之间的相互作用，并根据叠加原理形成一种新的波型。与光波干涉有关的参数是光波的振幅。如果两波干涉，所产生的光波的振幅将等于这两波干涉的振幅的矢量和。

如果产生的波的振幅增加，则把干涉描述为相干的。如果两个波峰或波谷在同一时间点相遇，就会出现这种情况。一个波的波峰和另一个波的波谷也有可能在同一时间点相遇。这导致产生的波的振幅降低。这两种波之间的干涉称为破坏性波。

相位反差显微镜的关键元件是环形孔径和位相板。环形孔径被放置在聚光镜的前焦平面上，限制了光波穿透的角度。相位板位于物镜的后焦平面上，它有一个由一种材料制成的相位环，这种材料使通过它的光变暗，并改变其相位λ/4。λ代表光的波长。

在相衬显微镜中，在Köhler照明条件下，不与样品相互作用的光波在物镜的后焦平面聚焦为一个明亮的环。光环沿光轴与相环在空间上匹配，使未偏光发生相移。被样品衍射的光不主要照射相位环，因此不受影响。

在受影响的光波和未受影响的光波之间，总相移高达λ/2。未偏光的相位在相环处超前λ/4，生物样品的衍射光波通常滞后λ/4。总相移λ/2允许光波在像面的破坏性干涉。为了使通过相位环的未偏光变暗，重要的是要避免未偏光与偏光相比的眩光。

在相衬显微镜中观察到λ/2相移，当波峰和波谷在同一时间点有效相交时，产生最大的破坏性干涉效应。因此，光波的振幅被减小，相物的相移被转化为振幅移。

相位对比有两种形式:正相位对比和负相位对比。它们的主要区别在于用于照明的相位板。在正相位对比中，通过相位环的光的相位比偏光的相位提前，而在负相位对比中则相位延迟。在负相位对比中相位的延迟导致了相位差的破坏。光波是相位差的，发生的不是相干干涉，而是相长干涉。这导致产生的光波振幅增加。

在正相位对比度显微镜下，具有比周围介质更高的折射率的物体比具有较低折射率的物体越暗。对于负相位对比度，相反适用。

相位反差显微镜可以显示样品的光程长度的差异。光程长度与样品的厚度和折射率有关。细胞质膜和细胞器等细胞结构对光程长度有着深刻的影响。由于许多细胞(特别是在细胞培养中)具有平坦和规则的形状，在亮场显微镜下很难看到它们。

由于光密度对样品或材料的折射率有很大的影响，这种细胞的相位对比图像放大了细胞结构的差异，可以看作是光学密度图。然而，一些影响使相位对比度图像的正确解释复杂化，因为它们不直接依赖于光程长度的差异。

晕轮效应描述的是大物体周围的亮边为正相位对比度，暗边为负相位对比度。光环的形成是因为一些来自样品的衍射光也穿过了相环。未偏移波形成的光环比相位环略小，来自样品的低空间频率衍射光波可以通过环。通过相位环的偏光保持90°的相位差，因此不受破坏性干涉的影响。这导致了对比的逆转，并导致了大物体边界上的光晕。

遮蔽效应描述了样品的均匀部分以与周围介质相同的光强度显示的情况。尽管通过这些区域的光经历相移，但仅发生次要衍射并且散射角度大大降低。因此，这些光波进入相位圈，如未提供的光，并且不经历干扰。

相位对比显微镜中的另一个问题可以是对比度反转。如果在具有低折射率的物体旁边有具有非常高的折射率的物体，则它们将出现更明亮而不是较暗（用于正相位对比）。在这样的区域中，相移不是用于生物样本的λ/ 4的通常偏移，而不是发生破坏性干扰，发生建设性干扰（对于负相位对比度相反）。

虽然这些效果可以使相位对比图像的解释难以，但相位对比显微镜是用于成像相对象的方便和重要的光学对比度技术。另外，相位对比度显微镜可以调查现场标本中的蜂窝功能和结构，使其成为最常应用的对比的方法在生物研究。