将活体样本可视化的挑战
亮场显微镜通常只提供一个弱图像的未染色标本，其中只有少数细节可检测。一个更强的对比对于看到更多的细节是很重要的。增强对比度的一种方法是对样品进行染色。然而，由于这对生物体来说是不可能的，所以它们保持本色，看起来不显眼。在光学显微镜中，这些样本也会与入射光相互作用。然而，发生的相移是肉眼无法检测到的。眼睛只能感受到振幅(亮度)和频率(颜色)的变化。
对比是指区分样本和背景，发现样本细节的可能性。它被定义为图像和相邻背景之间的光强度与整体背景强度的差值。对于人眼来说，这些差异至少需要2%才能被检测到。使用可以实现很大的改进照片探测器。
然而，对比度不仅仅是由样品及其与光本身的相互作用决定的。用于观察标本的光学系统及其记录图像信息的能力也很关键。在一个微观系统，对比度取决于正确的孔径设置、光学像差的等级、所用的对比度方法、标本和探测器。
因此，通过改变膜片的孔径设置，光学显微镜获得的图像的对比度可以独立于对比度方法而受到影响。但是，例如，如果冷凝器停得太远，分辨率就会受损，可能会出现衍射伪影。
要达到充分的对比，最古老的方法可能是先对样品染色。通常，这只可能是死的材料，偶尔需要一些复杂的染色方案。如果想观察活细胞，染色是不容易做到的。因此，不同的技术——由适当的光学显微镜提供——旨在将由光与标本相互作用引起的相移改变为振幅移。
光与标本的相互作用
如果入射光照射到标本上，它们就会相互作用。吸收、反射、衍射、光散射和折射都是可能的结果。在这个过程中，入射光波发生了变化。相移和振幅的变化都是可能的。
在这方面，可以区分相位和振幅物体。理想地描述，相位物体是改变相位而不是改变光波振幅的样本。相比之下，振幅物体只影响光的振幅而不影响光的相位。扁平和未染色的细胞几乎达到了可见光相物体的特性。由于它们只会导致人眼无法看到的相移，它们在亮场显微镜中的对比度很低。振幅物体本身可以在亮场显微镜下很好地成像。它们降低了通过的光的振幅，从而降低了光的强度。
染色或自然着色的物体可以很好地显示在明亮的领域。它们属于振幅物体。它们减少通过的光，从而减少波前的振幅。但它们不是理想的振幅物体。除了振幅外，它们还会影响击打光的组成。它们吸收或反射特定频率的波，而其他波长的光可以不受阻碍地通过。
由于样品和周围介质的折射率不同，会发生相移。如果光波进入细胞，它将准减速，而振幅保持不变。当光离开细胞时，它恢复速度，并以相同的频率、波长和振幅穿过介质。然而，与光相比，它的相位发生了变化，光只穿过了介质。
考虑到人类的眼睛和其他光学探测器无法识别和检测光波的相位变化,对比方法的主要目的的清白的,本色的标本是生成一个振幅对比和改变相衬到一个振幅的对比。
对生物学研究有重大影响
与使用固定和染色的物体相比，使用未染色的标本提供了许多优点。它允许在生物显微镜下观察活体物体，这是没有固定和染色的人工制品。例如，固定和染色可以使标本收缩或膨胀。此外，还存在破坏细胞中不同结构或实质上改变其形态的风险。消除这种危险的唯一可靠方法是使用活体样本，这些样本没有人工制品，提供可靠和真实的信息。
活细胞显微镜的另一个巨大优势是检查时间依赖的情况。除了获得细胞的静态信息和状态快照，整个过程可以随时监测，如细胞运动，细胞分裂和凋亡。由于这些过程有时可能会花费大量时间，因此建议添加相机用于记录慢速电影的光学显微镜系统。
不同的光学对比方法所获得的信息和印象因其来源而异。因此，我们建议将不同的对比技术结合起来，以获得被检查标本最准确和详细的图像。而亮场通常不允许精确观察细胞的形态，其他光学对比方法可以提供进一步的见解。
更多信息可以通过添加获取荧光标记的生活形象的细胞。细胞中感兴趣的蛋白质可以用类似荧光蛋白的标记绿色荧光蛋白。然后，它的定位可以通过光显微镜图像追踪和精确确定细胞内。也有结婚的可能性绿色荧光蛋白到肽定位信号。通过这种方式，可以看到像内质网这样的不同的隔间。
用于研究的现代光学显微镜通常采用模块化设计，可以在不同的对比方法之间快速切换，甚至可以同时应用。光学对比方法提供了在日常实验室中容易检查活的和无色的标本的潜力。
