观察和分析活细胞的挑战
在固定的细胞或组织中，获取样品的“分子状态”信息已经是一项艰巨的任务。如果必须实时获取信息，这将变得更加困难，因为在实验过程中，细胞必须尽可能自然地运作。此外，大量的信息必须在相对较短的时间内采样，因为许多事件只持续几秒钟甚至几毫秒(例如细胞离子水平的变化)。
解决这些挑战性需求的一种方法是某些统称为活细胞成像的光学方法。活细胞成像允许研究活细胞的动态生理过程，而不是给出细胞当前状态的“快照”。它将快照转换为电影。活细胞成像提供了单细胞、细胞网络(原位)，甚至整个生物体(在活的有机体内)．这些特征使得活细胞成像成为解决细胞生物学、癌症研究、发育生物学和神经科学中生理问题的必要技术。
近年来，电子学、光学和生物化学的重大进步使科学家们很容易实现活细胞成像。使用优化的显微镜，专用光源，高速摄像机，高灵敏度探测器和独家开发的荧光标记，活细胞成像方法提供了两者-技术成熟和仍然创新的工具集，以解决实时在分子水平上研究单个细胞或整个细胞网络的挑战性需求。
用线粒体标记(mitor®)和荧光钙染料(Fluo-4)对细胞进行活细胞成像
用徕卡共聚焦显微镜获取的图像TCSSP5 (DMI6000 CFS)和徕卡拉斯维加斯AF7000成像软件。由Sophie Veitinger博士提供，亚琛工业大学第二生物研究所，化学感觉系，德国。现任地址:Sophie Veitinger博士，菲利普大学马尔堡，细胞生物学和细胞病理学研究所，德国
活细胞成像的一般问题
活细胞成像通常可以用培养的细胞系(如HEK细胞、HeLa细胞)、原代细胞培养(如皮肤细胞、神经细胞)、急性切片制剂(如大脑切片)或整个器官或生物体进行。一项主要任务是在实验过程中保持细胞处于健康状态，因为细胞会受到光毒性的影响，并被带离“自然”环境。
Extracelluar解决方案
不同类型的人工细胞外溶液(林格氏液、人工脑脊液(ACSF)和培养基(如莱博维茨L-15)被用来为细胞提供必需离子和其他辅助因子，以维持其生理功能。用于活细胞成像的介质组成范围从非常简单的“咸”溶液(例如，林格氏溶液)到相当复杂的混合物(例如，莱博维茨L-15)。
然而，所有的溶液都有一个共同点，即pH缓冲系统，因为暴露在环境中会极大地改变介质的pH值(通常是pH 7.2 -7.4)。在许多细胞外溶液中，ph缓冲是通过添加10 - 20mm HEPES(2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸来实现的，这是一种两性离子有机化学品。不幸的是，对于许多细胞来说，细胞外溶液不能用HEPES或其他化学缓冲液(如MOPS, TES)缓冲，因为介质中缺乏ph缓冲的碳酸氢盐会损害细胞。为了克服这个问题，二氧化碳必须被输送到细胞外溶液中(当二氧化碳与细胞外溶液接触时，二氧化碳被转化为碳酸氢盐)。188金宝搏的网址这可以通过两种方式来实现:一种是不断地向细胞外溶液输送气态二氧化碳(通常以碳的形式:95%的氧气和5%的二氧化碳)，并不断地对细胞进行再灌注。这种方法通常用于比细胞培养物代谢转化率更高的切片制剂。
另一种常见的方法是将细胞保存在设计用于调节气氛的培养室中，在许多情况下，还包括温度。在这种培养环境中，二氧化碳含量为5 - 7%的大气可以持续供应，温度可以严格控制。然而，为了决定化学缓冲的细胞外溶液是否足以保持细胞处于良好状态，或者是否有必要输送二氧化碳，甚至使用气候室，人们必须考虑所使用的样品类型和实验的持续时间。在许多情况下，化学缓冲溶液足以进行细胞培养和相当短的实验。处理急性切片通常需要足够的二氧化碳供应，因为代谢周转要高得多。然而，对于许多类型的细胞和长期实验，气候室是强制性的。
光毒性
用荧光染料进行活细胞成像的另一个问题是激光或高强度电弧放电灯的入射光对细胞造成的损伤，即所谓的光毒性。光毒性主要发生在合成荧光染料被激发时。在激发态下，许多自由基与氧分子反应产生自由基。为了避免光毒性，必须选择尽可能低的光强度和尽可能短的激发持续时间，以保持入射高能光的剂量尽可能低。在实验设计中，还必须考虑实验的持续时间。在长期实验中，高帧率通常是不必要的。因此，图像采集的周期频率通常可以显著降低，例如从每秒10帧以上降低到每秒1帧甚至更低。这大大降低了入射光对样品的剂量，因此大大降低了光毒性。
人们可能还会考虑改变图像采集设置，因为在大多数情况下，低强度的荧光信号可以通过使用相机功能作为分仓或改进增益或使用特殊的低光相机(例如。新兴市场-CCD相机)。这样做，可以在不增加激发持续时间或光强的情况下获得更好的信噪比和信号质量，这两者都会导致更高的光毒性。此外，选择具有长激发波长的荧光团可以防止光毒性，因为与具有短激发波长的荧光团相比，传递到样品的能量较低。荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白))，通常没有光毒性，因为它们的光活性位点位于蛋白质深处，被多肽包膜覆盖。
焦点漂移
此外，焦点漂移的发生，特别是在长期实验中，可能是活细胞成像实验中的一个问题。这可以通过使用配备了软件或硬件控制的自动对焦的成像设置来避免。
图5:豇豆(Vigna unguiculata“California blackkeye”)的初生叶接种了含有该病毒的豇豆花叶病毒(CPMV)绿色荧光蛋白-插入病毒RNA中运动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CPs)之间的基因。的绿色荧光蛋白作为一种游离蛋白大量表达(因此不与MP或CP融合)，可定位于受感染的表皮和叶肉细胞的细胞质和细胞核中。Joan Wellink博士，生物分子科学系，实验室。分子生物学教授和Jan van Lent博士，植物科学系实验室。荷兰瓦赫宁根农业大学病毒学教授。
视频1:用DIOC6染色活洋葱球细胞，同时透射光检测;用徕卡共聚焦显微镜拍摄TCSSP2国内企业RS，物镜63倍，变焦1.5，两倍折线平均，格式512 x 265，每秒4.7帧。
视频2:COS细胞瞬时转染表达a的结构绿色荧光蛋白融合蛋白。主要的胞浆蛋白在细胞内形成针状结构。3D堆叠(10.14 μ m)每5秒记录一次，每堆叠14个切片，持续10分钟。在电影中使用了堆栈的最大投影。512 x 512像素，双向扫描，缩放2，物镜HCX7月L U-V-I 63.0 x 0.90 W紫外线．由Jocelyn Laporte提供，Equipe Génétique Humaine，中央图像，IGBMC，伊尔基希，法国。
活细胞成像方法
应用于活细胞成像的宽视场和共聚焦显微技术的范围也非常广泛。通常，细胞的生长，细胞聚集或细胞运动是观察随着时间的推移使用复合显微镜和对比方法，如相位对比和差分干涉对比(迪拜国际资本)．此外，大样本的延时成像，例如发育中的斑马鱼胚胎，通常使用立体显微镜或宏观显微镜进行。近几十年来，先进的荧光技术变得越来越重要。共聚焦显微镜应用的迅速增加，使生物研究的视角从平面向三维转变。
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