哺乳动物细胞培养介绍

哺乳动物细胞培养系统可以根据几个不同的特性进行细分。最明显的是它们的形态。由于出现在显微镜可以区分成纤维细胞或成纤维细胞样细胞、上皮细胞样细胞和淋巴细胞样细胞。

成纤维细胞的或呈细胞是双极或多极体，形状伸长（图1）。它们附着在基板上并经常与平行组件一致。在生物体中，成纤维细胞分泌细胞外基质并且是结缔组织的一部分。此外，由于它们的多极体形状，神经元细胞可以在成纤维细胞样细胞中排列。

上皮样细胞具有多边形形状，并且通常显示更多规则的尺寸。它们在离散贴片中依附于基板（图1）。上皮细胞表现出具有两个结构和功能不同的子区域的血浆膜。而顶端膜面对培养基，则基石膜在单个细胞和培养容器之间传播。两个膜结构域通过紧密结分隔。在活的有机体内那上皮细胞系列身体结构。

Lymphoblast-like细胞显示球形轮廓，并且通常在悬浮液中生长（图1）。与纤维细胞或上皮样细胞相反，它们不附着在表面上。淋巴细胞样细胞的一个很好的例子是血细胞。

哺乳动物细胞培养系统的另一种分化是使用的细胞类型。根据它们的起源，细胞可以细分为永生化细胞系，原代细胞和干细胞（包括患者特异性细胞）。

使用中最常见的单元格类型可以追溯到永生化细胞衍生自癌组织或用癌基因转染。由于他们的恶性背景，他们无限期地分裂。这一事实使它们变得非常容易作为细胞系文化。它们也是强大而实惠的。

另一方面，人们应该考虑其突变的遗传背景并非非常接近大自然。一个非常突出的例子是来自宫颈癌的HeLa细胞系。与正常人体细胞的46染色体相比，它们的核具有约80染色体。其他常用的永生化细胞系是HEK，A549，Jurkat，MDCK，COS或Vero细胞。

主细胞直接从活体组织中提取对于培养，原始组织碎片被酶解，化学，或机械成单个细胞，可以播种在培养瓶上。原代细胞比不朽细胞系更难培养。它们的存活率很低，而且很多都不会分裂。此外，它们的基因操作也具有挑战性。然而，这可能是值得努力的，因为它们的特征更接近自然细胞。换句话说，用原代细胞获得的科学结果可以转化为在活的有机体内世界更有信心。

干细胞是身体的创始细胞。它们可以与非专业化细胞区分成专用特性和功能的专用组织细胞。因此，它们被分组为几个类。多能干细胞是最通用的，并且能够区分为任何类型的体细胞。与多能干细胞相比，多能干细胞显示有点有限的分化范围。Bipotent干细胞只能发展成两种不同的细胞类型。干细胞也分裂，即它们除了区分专门的细胞类型之外，它们还可以自我更新。

干细胞的来源变化。典型地从胚胎中获得它们 - 所谓的胚胎干细胞。其他可以从某些组织中提取其他组织。骨髓含有血液干细胞。这些细胞称为“组织特异性”或“成人”干细胞。由于道德问题，从活血或人类中获得干细胞很难证明。这就是为什么诱导已经分化的身体细胞转化为干细胞的机会获得了很多兴趣。体细胞可以通过仅具有四种基因进行转染重编程（C-MYC，KLF-4，OCT-4，SOX-2），导致所谓的诱导多能干细胞(iPSC)。

尽管干细胞的研究具有挑战性，但它们给了研究人员最大的灵活性。根据细胞培养基中所含的成分，如某些营养物质和生长因子，干细胞可以被触发发育成一种独特的细胞类型，如神经元。

特别是在临床环境中，由于研究人员能够获得，IPSC非常重要特定疾病或甚至患者特定于患者细胞去找解药。这种个性化药物有望成为非常有效的治疗方法。

上述所有不同的细胞类型都可以以不同的方式生长。例如，细胞培养物可以仅由单个细胞类型或各种细胞培养物组成。此外，细胞可以以2D或3D取向组织。

培养细胞最简单的方法是在普通的培养皿中培养，细胞在培养皿的底部生长单层(图4)这种单细胞类型的单细胞培养是简单且经济的。因此，在经典容器中培养的HeLa、MDCK、HEK细胞等，几乎在每个细胞生物学实验室都能找到。另一方面，2D单细胞培养也是维持细胞的最人工的方式。有两个主要论点支持这一结论:1)在活的生物体中，细胞是三维生长的;2)它们不会与其他类型的细胞分离生长。

接近自然的一步就是共培养二维的几种细胞类型。共培养细胞系的例子是神经元原代培养的胶质细胞与神经元生长在一起(图4)。

要进入3D世界，细胞生物学家必须申请某些技巧。其中一个是带走细胞的机会粘附到基材上。这可以通过使用具有特殊涂层的细胞培养容器，或使用凝胶基质（例如Matrigel TM），或者通过在“悬挂液滴”中培养细胞来实现。以一种简单的方式表达，如果细胞不能坚持培养皿，它们互相坚持。结果，几千个单个细胞可以坚持形成所谓的球形直径为200 - 1000μm。这种物体具有更现实的组织，包括在天然组织中常见的代谢和增殖性梯度（图4）。这一事实是球形常用于药物发现的原因，因为它们精确地模仿了缺血性肿瘤。

在更现实的3D环境中种植细胞的另一种方法是使用支架．由金属、聚合物或陶瓷制成的基质可以用来帮助细胞进入三维形态。这些支架可以作为临床植入物或实验室应用。

一个类似的原理在Organs-on-a-chip它由一个微流控装置组成，该装置被不同类型的细胞定植。该微流体装置可以有多个连续灌注的腔室。通过这种安排，研究人员可以在组织和器官水平上模拟生理学。膜和可伸缩材料的额外使用创造了与自然惊人相似的人工结构，例如模仿呼吸或转移等动态过程。

另一个非常现实的细胞培养组织基于干细胞，其在细胞外基质凝胶内的不同生长因子存在下培养。取决于生长因子（例如FGF，EGF等）和其他成分的类型，干细胞发展成迷你器官瀑样（图4）。它们非常紧密地相似密切，并显示有机型开发和器官特定功能。因此，脑，胃，肝，肠等有机体可用于研究疾病和器官发展或运营药物发现和毒理学研究。

必须保持哺乳动物细胞培养物温度37°C。通常，它们是在各种形状和大小的特殊一次性塑料容器中培养的(图5)。其中最小的是96孔板，通常用于筛选应用。在另一个极端，有用于大规模生产疫苗或蛋白质的细胞工厂(图6)。细胞培养意味着在无菌条件下工作，例如在干净的工作台和使用抗生素。此外，他们必须提供适当的媒体含有营养素和生长因子。其中包括：

• 葡萄糖
• 丙酮酸钠
• 氨基酸
• 维生素
• 无机盐
• 水

由于其不稳定，通常以稳定的形式添加氨基酸谷氨酰胺。蛋白质，脂质或生长因子通常以胎牛血清的形式补充。

细胞的代谢产物使培养基酸化。因此，使用缓冲系统来维持pH值平衡(~7.4)。pH值通常由指示剂酚红监测。一般使用碳酸氢盐(HCO3-)缓冲液。它们结合质子(H+离子)的能力取决于周围二氧化碳的浓度。由于这个原因，细胞培养箱经常提供二氧化碳。HEPES缓冲液不依赖于CO2，通常用于没有CO2孵育的活细胞显微镜应用。

当涉及细胞培养物的显微镜检查时，显微镜必须满足的某些基本特征。哺乳动物细胞在液体培养基中培养的事实是指显微镜必须具有倒配置。在这种结构中，物镜安装在放在显微镜台上的培养容器下面，冷凝器安装在上面。只有这样，物镜才能与标本足够接近。此外，采用这种结构，研究人员在样品周围有了更多的自由空间(图6)。

要概述细胞培养的整体状态，100倍 - 200倍的放大率就足够了。哺乳动物细胞的低固有对比度要求显微镜提供特定的对比方法．相位对比和灯的对比是最常见的，而是差动干扰对比（DIC.）与通常用于细胞培养的塑料容器不兼容（图7）。

有了这种基本设备，研究人员就可以做出判断细胞数量和合流（图8）。后者描述了培养容器中的定植程度（以％）。取决于汇合，细胞必须将亚培养成其他血管。

如果研究人员不仅想要在细胞上快速瞥见，而且还记录细胞培养状态，然后是数字显微镜相机是必不可少的。此外，哺乳动物细胞经常转染的基因荧光蛋白．为了检查转染率，显微镜必须具有荧光照明能力，这意味着足够的光源加上相关过滤器。

1. 梁D，胡，徐T，王Y，Hu P，XU Z：发电Merrf患者衍生的多能干多能干细胞系IMErrf-C7。干细胞res。2016年11月5日;17 (3): 616 - 618
2. Weiswald LB，Bellet D，摇篮 - 玛丽V：肿瘤生物学的球形癌症模型。瘤形成。2015年1月;第17卷第1期1 - 15页
3. ESCH EW，Bahinski A，Huh D：在药物发现前沿的器官芯片。NAT Rev Disp Discov。2015年4月14日（4）：248-60．
4. Xinaris C，Brizi V，Remuzzi G：有机体模型和生物医学研究中的应用。188bet怎么注册肾2015;130：191-199
5. DEKKERS JF等人。使用源自囊性纤维化源自受试者的直肠有机体对CFTR调节药物的反应进行表征。sci翻译med。2016年6月22; ra84 8(344): 344。
6. Garcez PP等人。Zika病毒损害人类神经球员和脑器有机体的生长。科学。2016年5月13日;352 (6287): 816 - 8