2021年3月8日案例研究

用增强功能电子显微镜研究大脑切片中的突触

Flash和冻结

神经科学的一个基本问题是:突触的结构和功能特性之间的关系是什么?在过去的几十年里，电生理学揭示了突触传递机制和电子显微镜(新兴市场)对突触形态学有了深刻的认识。用于关联突触生理学和超微结构的方法可以追溯到20世纪中期。目的是获得突触传递的快照，即在电子显微镜中捕捉动态过程。其中一个函数新兴市场这种方法被称为“闪光和冻结”，它结合了光遗传刺激突触和高压冻结。在这篇文章中，讨论了一种创新的、增强的Flash和Freeze方法，它可以应用于哺乳动物急性脑切片和有机型切片培养的完整网络。研究了小鼠海马苔藓纤维- ca3锥体神经元突触突触传递过程中囊泡池的变化。结果表明，单次和多次刺激后囊泡会释放，与易释放池相关的停靠囊泡池的损耗以及快速的内吞作用。

作者

简介

细胞神经科学的一个主要焦点是更好地理解突触的结构和功能特性之间的关系。尽管我们对突触传递的认识取得了根本性的进展，但仍有许多问题没有得到解答。中枢突触的分子组成、结构和功能差异很大。因此，对清晰识别的突触进行分析对于解决这一知识鸿沟至关重要。

电子显微镜(新兴市场)提供了理想的空间分辨率，在纳米范围内，但它的缺点是只能捕获静态图像。在活体标本中分析突触，常使用共聚焦、2光子和光学超分辨率成像。然而，这些方法经常用于分离培养的神经元，一个简化的系统。此外，达到足够的分辨率来识别单个活动区域或单个突触囊泡是非常具有挑战性的。解决突触结构和功能之间关系的最佳方法应该提供纳米空间和毫秒时间尺度的信息。

这里描述了一种改进的“闪光和冻结”技术。这种改进的功能成像方法可以应用于急性切片和有机型切片培养，以探测突触传递过程中在确定的皮层突触中精确定义的时间点上的结构变化。这一进展是有可能的，因为使用了薄的急性切片，改进的载流子几何形状，恢复协议，优化的冷冻保护和冷冻替代。

作为概念证明，Flash和Freeze应用于海马苔状纤维突触之间的齿状回颗粒细胞和锥体神经元，一个关键的突触在海马三突触回路。苔藓状纤维末端形成较大的突触接触，具有明显的超微形态结构，即有大量的突触囊泡，囊泡直径变化，核囊泡188金宝搏的网址密集存在。从生理学角度来看，该突触具有一些独特的特性，包括低初始释放概率和突出的突触前可塑性。此外，冷冻法也成功应用于小脑和脑干。

方法

转基因小鼠被用来专门针对被研究的突触前神经元。在本例中，Prox1启动子被用于靶向齿状回的颗粒细胞。在选择性表达通道视紫红质方面，将Prox1-CreERT2系与报告小鼠Ai32 (ChR2(H134R)-EYFP系交叉。

免疫荧光和共聚焦显微镜检测EYFP在颗粒细胞中的选择性表达。用靶向EYFP的免疫标记预包埋实验，用电子显微镜检查选择性表达。

急性切片和切片培养的准备如上所述，以最佳保存海马苔藓纤维束[1]，用于电生理学和高压冷冻(HPF)实验。

首先，在急性切片和切片培养中对光刺激下的突触传递进行了彻底的电生理表征，以确定Flash和Freeze实验的最佳参数，如脉冲持续时间和频率。要注意使刺激的功率和强度与EM冰高压冰箱。

实验工作流显示了修改后的Flash和Freeze方法的工作步骤，如下图1所示。

然后，在光学刺激下进行HPF实验新兴市场ICE系统和冻结替代是用一种新兴市场AFS或EM AFS2系统[1]．切片和培养物中的组织在室温下用杜尔库潘树脂包埋，然后用an切成超薄切片EM UC7超微切片机[1]．

用透射电子显微镜观察样品(TEM)．根据苔藓纤维终端的特点和形态特征，在海马CA3区发现了苔藓纤维终端。在所有对照组和实验组的分析中，重点关注活性区停靠泡囊的数量和直径，以及活性周围区域潜在的内吞坑形成。所有数据均进行正态性检验，随后进行非参数或参数检验的统计分析。

结果

海马颗粒细胞的选择性光激活及诱发对CA3锥体神经元的突触传递

这是第一个要克服的挑战新兴市场对苔藓纤维- ca3锥体神经元突触的选择性靶向和光激活颗粒细胞。用Prox1启动子在颗粒中选择性表达通道视紫红质。Prox1-creERT2小鼠线与Ai32 (ChR2(H134R)-EYFP)报告鼠线交叉。通过荧光共聚焦显微镜和电子显微镜预包埋实验的免疫标记来验证EYFP的选择性表达。

然后，通过急性切片和有机型切片培养的电生理实验确定光遗传刺激的最佳设置[1]．光脉冲的强度与HPF装置中达到的强度相匹配。这些实验确定了用于颗粒细胞激活和动作电位诱发突触向CA3锥体神经元传递的最佳脉冲持续时间和频率。对于这种特殊的鼠标交叉线，我们发现最好的参数是5毫秒光脉冲应用在最高20 Hz的频率。

功能性急性切片的高压冷冻新兴市场

将HPF技术应用于急性切片和有机型切片培养中，目的是通过Flash和Freeze实验检查其原生网络环境中的中枢突触，需要一些改进，以克服现有的限制。在非固定有机型切片培养中，已有标准的高效液相色谱实验。因此，有机型切片培养可作为急性脑切片HPF方法优化的参考[1]．新兴市场HPF后急性切片的显微照片如下图2所示。

图2:新兴市场HPF后小鼠大脑急性切片中海马CA3区显微图:a)放大倍数下的图像显示苔藓纤维束轴突(绿色箭头)穿过透明层，CA3锥体神经元的基部树突(蓝色箭头)穿过苔藓纤维束，几个苔藓纤维扣(红色箭头)坐落在这些树突和轴突之间。B)高倍镜图像显示苔藓纤维扣(红色箭头)充满突触囊泡和苔藓纤维轴突(绿色箭头)。

首先，采用与电生理实验相似的方法，对HPF实验进行急性切片制备。恢复期对神经健康至关重要，也包括在内。切片厚度为150 ~ 200 μ m;第三，使用更大直径的蓝宝石夹层与间隔环(6毫米外径和4毫米或5毫米内径)。这些三明治使得整个切片准备工作都可以被冷冻，而不需要进一步修剪，因此整个具有网络的目标大脑区域都是完好无损的。优化了冷冻保护的浓度和时间。切片保存在接近生理温度，并浸泡在人工脑脊液(ACSF)中，也用作填充介质。就在关闭三明治之前，添加了含有15%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的ACSF作为低温保护剂，以防止冰晶的形成。最后，仔细测试和开发优化的加速冷冻替代方案，以获得最佳的超微结构。除了海马体，该方法还成功地应用于小脑和脑干区域。 Ultrastructure analysis was focused on identified active-zone and peri-active-zone regions[1]．

这些改进导致在急性切片中形成了最佳保存的超微结构，可与高压冷冻有机型切片培养的超微结构相媲美，用于无光遗传刺激的HPF实验。在无刺激的实验对照条件下，对对接囊泡池的分析表明，与有机型切片培养相比，急性脑切片中囊泡的数量和直径更高。

停靠囊泡池的刺激依赖性耗竭

在轻度和强光刺激后，急性切片上的滞留囊泡池分析有以下发现[1]．单个脉冲触发1动作电位后，停靠囊泡的数量略有减少，但不明显，反映出苔藓纤维向CA3锥体神经元突触释放的概率较低。然而，停靠囊泡的平均直径显著增加，这表明在单一刺激后，较小的囊泡有更大的机会首先被释放。经过5次脉冲的短暂刺激后，滞留的囊泡显著减少，提示囊泡释放，并在切片和培养物中观察到推定的内吞坑形成。最后，在一个强刺激范式之后，以前被用作一个易于释放的池-耗尽刺激(100次脉冲，20赫兹)，在急性脑切片和有机切片培养中，固定的囊泡池基本耗尽[1]．结果的概览如图3所示。