GSDIM方法对您的研究有什么优势?
在我们的研究中,我们试图了解大型多蛋白复合体,如核孔复合体(NPC)是如何构建的。由于其体积和复杂性,这种分子机器超出了单一方法的范围,长期以来一直是结构生物学的挑战。原子分辨率的方法,如x射线晶体学或核磁共振需要纯化的样品,不适合非常大的组件。虽然电子显微镜可以观察到细胞内天然环境中的大型复合物,但通常很难将电子密度分配给单个蛋白质。在荧光显微镜中,蛋白质的身份是已知的,超分辨率(SR)现在允许我们看到衍射极限以下的细节。当SR与粒子平均相结合时,蛋白质的位置可以映射到亚纳米精度,这使得光学显微镜适用于大型配合物的结构研究。因此,SR显微镜可以连接不同类型的数据,并最终帮助生成多蛋白质组合的伪原子模型。此外,尤其的一大优势GSDIM和其他定位SR方法的优点是它们使用相对简单,通常允许分离10 - 20nm的蛋白质。这对我们来说很重要,因为我们可以获得大型数据集,并以相对有效的方式查看许多不同的标记。
它对核孔复合体的结构有什么新的见解?你第一次看到了哪些细节?
无花果。1:U2OS细胞的细胞核底面标记有抗核孔蛋白Nup133抗体和偶联Alexa Fluor 647的二抗。沿着传输轴观看的单个npc是可见的环形结构。比例尺:3 μm。
现在我们对核孔复合物的理解必须如何修正?
在我们最近的研究中,我们为Nup107-160子复合体的成员提供了位置约束,基于这些数据,我们能够解决该领域长期存在的争议:该子复合体相对于传输轴的方向问题。这是理解NPC的结构支架是如何组织的又一步。我们希望将来能够绘制出孔内的所有蛋白质,并提供这一重要运输机器的全面结构模型。
请描述一下您刚刚开发的将数千张超分辨率显微图像结合起来以达到一纳米以下精度的方法。
虽然SR显微镜使我们能够看到NPC中心周围核孔蛋白的组织,但这些图像的原始分辨率不足以直接看到相同亚复合物的单个蛋白质之间的微小差异。因此,我们开发了一种分析方法,在该方法中,使用特定标记标记的单个npc的许多图像在空间上仔细地对准孔的中心,或标记在第二通道中的参考蛋白的位置,然后汇总生成平均图像(见图2)。由于我们使用了相同结构的数千张图像,因此这种配准过程非常精确。然后,我们能够确定荧光标记的位置,通过拟合平均信号与适当的数学模型。重要的是,我们发现这种平均过程的精度在一定程度上取决于原始数据的质量。为了使我们的测量在不同蛋白质和实验之间具有绝对可比性,并去除低质量染色的潜在伪影,我们实现了一个自动化分析管道,控制定位精度和密度等参数。关于生产统计上显著的数据,我们还可以受益于的可靠性和稳健性GSDIM方法和有效漂移补偿(SuMo)级。
总而言之,我们的方法是通用的,并且允许确定荧光标记相对于对称结构或参考蛋白中心的位置,具有亚纳米精度和准确性。将这种方法应用于核孔的几种不同蛋白质,我们可以分配它们相对于结构中心的相对位置。这些信息使我们能够确定NPC支架中单个子复合物的方向(参见图3)。
无花果。3.:将平均程序应用于Nup107-160亚复合体的几个表位(用不同颜色表示),可以确定它们的相对位置。用纳米体标记进行染色绿色荧光蛋白融合蛋白。位置信息与新兴市场鼻咽癌细胞质环的结构。电子密度图由O. Medalia教授提供[5].
在制备超分辨率样品时必须克服的一般障碍是什么?你在这项研究中使用了哪些标记?
在这个项目中,我们意识到获得最好的荧光标记是SR实验中最关键的步骤之一,而超分辨率方法通常需要比传统显微镜更高质量的样品。虽然样品制备的几个方面,如低背景和良好的结构保存,是重要的,但在我们的情况下,两个最限制因素是标记试剂的大小和可实现的标记密度。最初,我们使用了间接免疫荧光与抗核蛋白抗体,这允许特定标记细胞内的内源性蛋白质。然而,使用抗体的一个主要限制是它们的大小——它们可能会将荧光团与靶向表位的距离抵消最多15纳米。此外,我们的平均方法要求样品具有较高的标记密度。这只能通过非常高亲和力的抗体来实现,我们只能获得我们感兴趣的核孔蛋白子集的试剂。我们通过表达核孔蛋白来解决这两个问题绿色荧光蛋白融合蛋白,并用荧光标记的小抗体染色样品绿色荧光蛋白nanobodies[6]它们的大小只有传统IgG的十分之一,因此将潜在的偏移量减少了一半以上。重要的是,由于这个标记是基因编码的,它允许我们以一种直接和可比的方式标记几个核孔蛋白。为了达到最大的标记密度,我们通过RNA干扰来消耗内源性的未标记蛋白。
你认为在你的研究领域使用新的GSD 3D技术有什么可能性?
像所有大型蛋白质复合物一样,NPC是一个3D结构,为了了解它是如何构建的,超分子组装的所有部分的高分辨率3D视图将是必要的。虽然我们最近的研究为NPC支架的组织提供了新的见解,但我们只能确定核孔蛋白在一个方向上的位置——沿着孔的半径。在3D中进行这样的测量将提供更多的信息。
此外,我们相信,超分辨率显微镜将是一个有价值的工具,不仅在核孔的结构研究,而且在其他大的蛋白质组合。然而,在NPC的例子中,我们得益于细胞核底部数百个孔在同一方向上可见的事实——这简化了我们的分析。在许多其他有趣的多蛋白组合中没有发现这种优先取向,而且这种复合物的超分辨率结构研究只有通过3D成像才能实现。
参考文献
- Szymborska A, de Marco A, Daigle N, Cordes VC, Briggs JAG和Ellenberg J:用超分辨率显微镜和粒子平均分析核孔支架结构。科学学报(自然科学版)(2013):344 - 344。
- Ori A, Banterle N, Iskar M, Andrés-Pons A, Escher C, Khanh Bui H, Sparks L, Solis-Mezarino V, Rinner O, Bork P, Lemke EA和Beck M:细胞类型特异性核孔:分子机器环境依赖化学计量学的一个案例。摩尔。系统。生物学报,9:648(2013)。
- Löschberger A, van de Linde S, Dabauvalle M- c, Rieger B, Heilemann M, Krohne G和Sauer M:超分辨率成像可视化了gp210蛋白在核孔复合物周围的八重对称性,并以纳米分辨率解析了中心通道。中国生物医学工程学报(自然科学版),37(3):344 - 344(2012)。
- Göttfert F, Wurm CA, Mueller V, Berning S, Cordes VC, Honigmann A和Hell SW:协同双通道STED纳米镜和分子扩散分析在20纳米分辨率。Biophys。J. 105 (1): l01-03(2013)。
- Maimon T, Elad N, Dahan I, Medalia O:人体核孔复合物的冷冻电子断层扫描。结构体。Lond。工程学报,1999,20(6):998-1006(2012)。
- Ries J, Kaplan C, Platonova E, Eghlidi H和Ewers H:通过纳米体进行基于gfp的超分辨率显微镜的一种简单、通用的方法。方法9(6):582-84(2012)。