2017年5月15日故事

利用电脑是什么?

新的科学工具箱。为什么它很重要？你如何使用它？

术语“光操作”描述了一系列技术，通过提供一种通过目标照明与样品交互的方式，使显微镜操作员能够从被动观察者过渡到事件的煽动者。通常，研究人员正试图观察感兴趣的特定过程，以了解潜在的生物过程。在能够观察到感兴趣的事件之前，显微镜学家常常被迫在大量细胞中搜寻或获取数小时的时间圈镜头。在许多情况下，仅仅使用传统的显微镜技术是不可能观察到某些过程的。光操作工具使显微镜操作员能够启动生物事件，精确调整样品标签、生物活性、局部化学环境，在某些情况下，还可以物理破坏其样本的部分。当涉及到解除复杂的、条块化的生物机制时，这些能力是非常有价值的。光操作工具使用户能够设计先进的实验，从样本中获取额外的信息层，而这些信息层仅凭观察是不可能的。

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荧光显微镜

光漂白与F字

光漂白是一种光化学过程荧光团的强烈激发使其永久不能发出荧光．荧光团附着的蛋白质仍然具有生物活性，有效地使使用者产生两种不同的蛋白质种群(荧光/非荧光)。F字描述了一系列的技术，包括漂白荧光团使用短脉冲定向照明，然后记录剩余标记种群的重新分布。这些技术使用户能够定量研究标记蛋白在亚细胞结构中的区隔化和周转［１］．

光漂白后的荧光恢复(收紧)涉及到将标记的部分漂白，并通过未漂白的蛋白迁移到漂白区域来记录目标区域荧光信号的恢复[2]（s.图1）。通过绘制恢复曲线，用户可以量化恢复率，并区分单相和多相恢复曲线。该技术使用户能够探索感兴趣结构的翻转和划分。荧光蛋白荧光标记只能让你观察蛋白质的位置；它不允许你窥视表面上固体标记的物体（囊泡/细丝）以了解分子如何在结构中移动和翻转。除此之外，物体的内部动力学在细胞的不同区域可能有所不同，或者对细胞因子或病原体等外部刺激作出反应。简言之收紧仍然是一种非常有用的技术，可以用来研究细胞内结构的可塑性、翻转性和相互连通性[3](图2)。

图1：收紧酵母细胞实验。这些酵母细胞的p体携带有荧光标记的蛋白质。在…的过程中收紧实验一个小的结构可以漂白和恢复可以观察(箭头)。

光漂白中的荧光损失(轻弹)是另一种可以被认为是相反的漂白技术收紧．随着时间的推移，对目标区域进行反复漂白，并在每个漂白周期后获取图像。不像收紧FLIP寻找目标区域内荧光的恢复，FLIP观察细胞其余部分信号的稳定丢失。这项技术揭示了分子在整个细胞中的流动性[4]并且使用户能够识别多个蜂窝隔间中的高换手率和低换手率区域。这项技术可以用来观察复杂的蛋白质周转途径，如细胞角蛋白，否则可能不明显。鉴于收紧使您可以研究特定区域内的翻转，FLIP使您可以观察整个细胞内分子的翻转和区隔化。

Förster共振能量转移(烦恼)，也称为荧光共振能量转移，是能量从一个荧光团转移到另一个荧光团的过程，可以用来测量分子间和分子内的距离。烦恼只发生在极小的距离(通常是1-10纳米)，因此可以用来量化和绘制细胞内的结合和蛋白质相互作用。一旦被激发，供体荧光团将能量转移给受体荧光团，受体荧光团通常会以比供体更长的波长发射。的效率烦恼通常使用比率计成像或者通过供体荧光寿命成像的变化(飞行).什么时候烦恼发生时，施主发射猝灭，受主发射通道增加。在里面烦恼受体光漂白受体在目标区域被漂白，所以烦恼不能再发生，去淬灭供体的发射。施主信号的增加(去淬灭)可以用来直接测量烦恼效率

图2:图1:光漂白后荧光恢复过程(收紧)蛋白质的荧光标记被感兴趣区域(ROI)内的强烈激发漂白。随后的重新安置提供了洞察力，例如对利益结构的周转。在光漂白(FLIP)中，细胞内的ROI被反复漂白。漂白的分子扩散，荧光的丧失表明，例如，细胞器是否有物理连接。在逆收紧(iFRAP)， ROI外的细胞区域被漂白。随后，未漂白的分子扩散开来，可以被监测。

光致变色

与通过光漂白破坏染料的荧光特性相反，光操作也可用于激活许多光敏荧光蛋白．许多荧光团有能力在特定波长的光照下在不同的分子状态之间切换，这种特性被称为对光反应变色．光致变色可使荧光团在低荧光态和高荧光态之间切换(光活化)[5]，或在刺激下改变其发射光谱(photoconversion)［6］（s.图3）。

图3:光活化、光转换和光开关可以用来跟踪蛋白质种群的变化。光激活蛋白可以被特定波长的光“打开”。光转换蛋白可以改变其发射光谱，而光转换蛋白可以多次开关。

一个众所周知的光转换的例子是meo它在405nm的激活下呈现出从绿色到红色的开关，将其发射峰值从516nm转移到581nm。光激活蛋白质使用户能够跟踪一种蛋白质的两个不同群体（激活/非激活），而光转换蛋白质在尝试查看多个标记蛋白质时非常有用。光开关荧光蛋白表现出可逆的光致变色，并且能够在不同的状态之间反复循环，使用户能够打开或关闭它们(例如Dronpa)[6,7]）.有关更多信息，请参见光激活、光转换和光开关荧光蛋白．

光致变色的主要用途是跟踪随时间变化的活化蛋白种群。

图4:在光激活实验中，我们用pamCherry-H2B和eGFP-Actin转染HeLa细胞。经过光活化后，pamCherry表现出明亮的荧光。

值得注意的是，表现出光致变色的荧光团也可以用于单分子定位的超分辨率技术，如sptPALM和fPALM。一旦一种可光开关的融合蛋白被生产出来，它通常可以用于多种互补技术(8、9)．

当试图观察大量表达蛋白的行为时，光致变色蛋白特别有用。例如，光激活荧光团可以让用户在拥挤的环境中轻松跟踪特定物体。这种方法在尝试跟踪单个物体时很有用，使用长时间间隔来减少照片压力。光活性荧光团还可以让使用者看到不同细胞间隔之间的扩散，或检查可塑性，并在内部翻转看似坚实的结构，如细胞骨架丝。该技术使用户能够观察相邻物体之间是否发生亚单位交换。此外，该技术使用户能够研究物体的谱系，从膀胱融合和分裂，到子细胞的位置和身份[3]. 最后，光致变色蛋白质还可以用于脉冲追踪实验，通过该实验，细胞中的所有蛋白质都被转换，使用户能够区分光操作事件前后产生的蛋白质。最后，一些光开关蛋白也可以用作光遗传学除了改变染料的荧光性质外，发生的构象变化还用于改变其他共轭生物分子的活性[11]．

仔细考虑您的应用程序并根据您的要求选择合适的荧光蛋白(FP)是很重要的。例如，一些光激活FPs明显比其他的更亮paGFP亮度增加了约100倍[12]当被激活时，一些蛋白质凯德显示亮度增加2000倍［13］．更亮的FPs使用户能够跟踪少量的蛋白质，或使用户能够在低得多的激励设置下实现可比的信号和噪声水平，最大限度地减少光毒性。同样值得注意的是，光转换蛋白比光激活蛋白更容易处理，因为它们在激活之前是可见的。相反地，它们需要对一个蛋白质群使用两个成像通道，所以计划在一次实验中对多个蛋白质成像的用户可能最好使用光激活蛋白质。

光遗传学

除了控制荧光标签的属性外，还可以用电脑操作来处理选择性激活生物途径，利用光敏蛋白结构域的过程通常称为光遗传学．光遗传学工具使用户能够在指令下以高度定向的方式刺激细胞。经典的光遗传学包括靶向激活光敏离子通道来改变膜电压电位。最著名的光遗传学效应属于视紫红质家族。紫红质是非特异性的阳离子通道，然而阴离子导电的紫红质以及离子特异性通道已经被发现或改造［14］. 激活的下游效应可以通过电生理学或光学传感器（如比率计钙染料．光敏离子通道是非常有价值的工具，因为他们允许高空间和时间分辨率的刺激神经元和其他细胞类型。同样值得注意的是，G蛋白介导的信号的光控制也是可能的[15]．

除了经典的基于受体的光遗传学执行器，随着发现或许多其他光敏蛋白域，一个完整的光遗传学工具箱正在出现。感光域，如光、氧、电压(值列表)域,光敏色素或中一种从植物中，可以被改造成效应蛋白，使研究人员能够在他们想要研究的几乎任何蛋白质中构建光敏光遗传学促动器(14、16)．一个LOV域暴露在蓝光下会引起构象的变化。通过一些深思熟虑的蛋白质工程，这种变化可以用来激活或失活感兴趣的靶蛋白[17,18]．LOV结构域可用于诱导靶向DNA结合、蛋白二聚和酶的活化或失活。

图5:光遗传学利用光敏蛋白结构域来触发细胞机制。经典的光敏离子通道被用来改变膜电位。同时，另有蛋白质被驯化，经光照射后出现构象变化。这可以用来激活或失活靶蛋白，例如诱导蛋白反应。DNA结合或酶激活。

使用LOV结构域的一个例子是使用它来产生光敏RAC激酶。激活使该组能够有效地控制细胞运动[19]. 有趣的是，甚至基因编辑工具，如CRISPR/Cas9在光学控制下，通过添加名为磁铁，实现光学目标基因编辑。新兴的光遗传学工具包为新的研究途径提供了巨大的潜力。

切割和消融

除了用于调节蛋白质活性或染料的荧光状态外，光操作还可用于操纵样品本身的物理和化学状态．通过替换连续波激光常用于使用高功率脉冲激光器，它成为可能物理上破坏样品的部分或诱导化学试剂在样品和周围的光解。通过切割和消融，根据应用于样本的功率，效果可能不同于切割单个细胞骨架纤维或切断细胞的部分，这种能力可以用于许多不同的应用，使用户能够研究生物体对创伤的反应，并投资涉及修复的下游生物途径。这些能力有广泛的应用，从探索单个微管在有丝分裂中的作用[21,22]到伤口愈合、炎症和转移过程背后的机制。消融可用于在组织中制造伤口，使研究人员能够探索信号通路、细胞迁移和复杂多细胞过程中涉及的动力学。在发育生物学中，消融可用于敲除胚胎的一部分以观察对整个有机体的发育和组织的影响。

图6:为了研究神经元的再生能力，可以在脉冲激光的帮助下切断轴突(箭头)。消融和切割实验范围从整个细胞或细胞碎片到单个细胞骨架元素。理查德·伊娃，剑桥大学(英国)

解开

此外，电脑操作技术可以用于将生物活性化合物引入样品中以高度针对性的方式。许多有机化合物暴露在空气中时会发生光解紫外线光利用有机化学合成酶可以设计出化学封装的化合物，这些化合物完好无损时具有生物惰性，但暴露在环境中时会降解为生物活性化合物紫外线光这种化合物被称为关在笼子里的化合物这些化合物的定向光解称为解开．解封是一种常见的应用，在神经生物学中，它可以被用来将活跃的神经递质引入单个突触连接。到目前为止，市面上有很多笼状化合物，包括神经递质如谷氨酸和GABA，核苷酸如ATP和cAMP，离子如钙，甚至一些大分子(图7)。DNA和RNA也可以用商业上可用的试剂进行笼子，共价修饰特定的残基[23]．

图7：解封：化学封装的生物活性物质，如钙离子，称为笼状化合物。借助紫外线在光照下，螯合剂可能被破坏，导致笼状化合物的释放。

除了使用光操作物理破坏样品中的材料外，还可能对细胞造成非常特殊类型的损伤。一个这样的例子是使用紫外线激光将有针对性的断裂引入DNA。该技术可用于触发和研究细胞DNA修复机制。许多蛋白质参与了识别和反应DNA损伤在癌症的发展和治疗中都发挥着关键作用，因此根据需要激活这些途径的能力提供了极其宝贵的癌症研究工具[24]．

光处理技术提供了一套非常通用的研究工具，以及已经描述的应用程序，光处理工具箱还提供了其他一些不太为人所知的功能。这些包括使用红外激光引入目标热应力到细胞。光操作装置也可用于微模式包括蛋白质印刷和蚀刻在玻璃上以产生相关显微镜标记物。多光子激光器也可用于一系列的人造操作技术，如切割、释放、光开关和刺激，其主要优点是改进了三维瞄准能力。最后，还值得一提的是，可以结合诸如漂白和激活mEOS标记等技术来深入了解一些复杂的过程[25]．此外，漂白和激活技术可用于研究通过解封或光遗传学致动器靶向刺激前后的动态过程变化，或探索细胞对切割或消融事件造成的创伤的反应。

硬件太

有几种不同类型的技术可用于光操作，它们都有各自的优缺点（见图8）。最简单的方法是使用场隔膜在荧光灯路径中，以特定的波长照亮视场的中心，然后再次打开视场光阑并切换波长以进行成像。这种方法速度慢，瞄准灵活性差，只提供低功率照明，所以不适合大多数实验。然而，这对于基本的光激活是足够的，并且可以用来测试结构物的活性。由于大多数电脑操作实验需要更强的照明，激光通常是首选的照明源。激光装置如徕卡WF收紧提供优秀的基本工具收紧实验。一个强大的激光源对准图像的中心，光束在样本中的轮廓可以使用掩模修改，使用户能够拍摄有限范围内的ROI的大小和形状。这些设备的限制是，它们通常只提供一条激光线，限制了它们可以用于的实验类型。另一个限制是，由于它们不能在单个实验中针对多个或复杂的ROI，许多实验都超出了此类设备的能力。

更高级的photoman操作实验通常要求能够在一定波长范围内重复对样本中的任何区域进行操作。有两种主要的技术可以提供这种能力，即数字镜像设备(DMD),检流计扫描设备. 数字反射镜装置使用了一种芯片，该芯片包含数千个微小的反射镜，这些反射镜可以以高速电子方式切换到开启或关闭位置。整个芯片使用激光或LED照明，这取决于激活镜的模式。用户可以将复杂的照明模式投射到样品上。DMD使用户能够同时照亮多个感兴趣的区域。DMD的主要缺点是它们能够达到的最大功率密度相对较低，因为照明光分布在整个视野中。这使得DMD适用于某些应用，如一些光遗传学应用，但它们在高速功率饥饿应用（如漂白、切割和烧蚀）中挣扎。振镜扫描设备使用高速振镜扫描仪将聚焦激光束引导到样品上，使其成为最通用的光操作设备。振镜扫描仪通常作为独立的光操作设备，但也可以使用许多共焦扫描仪。根据耦合的激光器，它们几乎可以处理任何应用。衍射限制光束的使用使得振镜装置能够非常有效地漂白和激活。它们也可用于切割和烧蚀应用。一些振镜扫描仪还可以调整其光束轮廓，使用户在设计实验时具有更大的灵活性。

重要的是要考虑到一个操作系统只是一个完整系统的一部分，因此要从光学和软件的角度考虑操作设备与系统的集成程度。一个集成良好的设备不应该损害光路和软件应该使成像和操作任务无缝交错。操作的方便性和设计复杂的高级实验协议的能力也应该被考虑。

总之，由于操作能力的巨大范围，它为任何活细胞成像系统提供了极其强大的补充。通过光漂白和活化技术，使用者可以发现隐藏的动态过程。释放和光遗传学快速发展的领域，现在使用户能够刺激或抑制几乎任何生物途径与亚细胞分辨率和质谱精度。最后，切割和消融技术使研究人员能够对样本进行显微手术。当这些能力与现代成像系统相结合时，将为我们在广泛的研究领域进一步了解提供巨大的潜力。