荧光染料

在荧光显微镜中，有两种方法来观察你感兴趣的蛋白质。要么借助固有的荧光信号——这意味着通过克隆，从而将荧光蛋白与目标蛋白在基因上连接起来。或者在荧光标记抗体的帮助下，特异性地结合到感兴趣的蛋白质上。对于某些生物学问题，执行后者更有用，甚至是必要的。例如，在组织学样品的情况下，不可能使用荧光蛋白，因为一般情况下，样品来自不含有任何荧光蛋白的生物体。此外，如果有有效的抗体，免疫荧光技术比荧光蛋白技术快得多，你必须克隆感兴趣的基因，并将DNA转染到适当的细胞中。荧光蛋白的另一个缺点在于它们本身就是蛋白质。有了它，它们在细胞内具有特定的蛋白质特征，这可能导致功能障碍或对所附着的感兴趣蛋白质的误解。然而，应该考虑使用荧光蛋白通常是观察活细胞的选择方法。

免疫荧光利用抗体对抗原的非常特殊的结合亲和力。它可以有两种不同的外观。最简单的方法是使用一种荧光标记的抗体，它与感兴趣的蛋白质结合。这叫做直接免疫荧光．

在大多数情况下，使用两种形式的抗体。第一个结合到目标蛋白，本身没有荧光标记(1^圣抗体)。但是第二个(2)^nd抗体)它与1结合^圣抗体专门携带荧光染料。这个方法被称为间接免疫荧光法它有几个优点。一方面有放大效应，因为不止一个2^nd抗体与1结合^圣抗体另一方面，不需要一直用荧光染料标记针对你喜欢的蛋白质的每个抗体，而是使用商业荧光标记2^nd抗体。广泛用于免疫荧光的荧光染料有FITC， TRITC或几家Alexa Fluor^®下面提到的染料。

一种经常用于同口气的染料FITC是其发音相似的伙伴TRITC (Tetramethylrhodamine-5-(和6)-异硫氰酸盐)。相比之下FITC， TRITC不是荧光素，而是荧光素的衍生物若丹明家庭。罗丹明也有一个大的共轭芳香族电子系统，这导致了它们的荧光行为。相比之下FITCTRITC (479 g/mol)被绿色光谱中的光激发，最大值在550 nm。其最大发射波长为573 nm。与蛋白质(如抗体)的结合也是基于反应性异硫氰酸酯基团。

即使FITC和TRITC仍在使用，它们是相当弱的荧光染料，不推荐用于最先进的显微镜。他们的利润是基于他们的经济价格。

这种相对较少的荧光染料来源于花菁，这也是它们名字的来源:Cy2，Cy3，Cy5而且Cy7．它们都可以通过它们的反应基团与核酸或蛋白质相连。例如，蛋白质标记使用马来酰亚胺基团。有趣的是，关于荧光，Cy5对周围的电子很敏感。这可以用于酶的测量。所附蛋白质的构象变化导致荧光发射的正或负改变。此外，Cy3和Cy5可用于烦恼实验。菁染料是一种较老的荧光染料，是其它荧光染料的基础，具有较高的亮度、光稳定性、量子产率等优点。

荧光显微镜不仅对蛋白质结构感兴趣，而且对核酸也感兴趣。有时有必要通过检测细胞核来确定细胞的确切位置或数量。最常见的DNA染色之一是DAPI(4'，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚)结合到DNA双螺旋的A-T丰富区域。与未结合状态相比，DAPI附着在DNA上时荧光强度增加。它被激发紫外线-光，最大波长为358 nm。发射光谱宽，峰值在461 nm。微弱的荧光也可以检测到RNA结合。在这种情况下，发射转移到500纳米。有趣的是，DAPI能够渗透完整的质膜。因此，它既可用于固定细胞，也可用于活细胞。

第二个广泛使用的DNA染色选择是Hoechst染料家族，它最初是由化学公司Hoechst AG生产的。188金宝搏怎么注册赫斯特33258，赫斯特33342,赫斯特34580为双苯甲酰亚胺类化合物，在富含A-T的区域有插层倾向，因此后者不常使用。类似于让他们兴奋的DAPI紫外线-轻，在455 nm处有最大发射，在非束缚状态下转移到510-540 nm。赫斯特染色剂也可渗透细胞，因此可用于固定细胞和活细胞。DAPI的不同之处在于其毒性较低。

膜不渗透DNA染色是Propidium-Iodide．有了它，它经常被用来区分细胞培养中的活细胞和死细胞，因为它不能进入完整的细胞。碘化丙啶也是一种插层剂，但对不同的碱没有结合偏好。在核酸结合态下，其激发最大值在538 nm。在617 nm处发射最高。未结合的碘化丙激发和发射最大值移到较低的波长和较低的强度。它还可以与RNA结合而不改变其荧光特征。为了区分DNA和RNA，有必要使用足够的核酸酶。

一种染料能够使DNA和RNA之间的区别，而不需要事先处理吖啶橙．其最大激发/发射对在DNA结合状态下为502 nm/525 nm，在RNA结合状态下为460 nm/650 nm。此外，它能够进入酸性区室，如溶酶体。在那里，阳离子染料被质子化。在这种酸性环境中，吖啶橙被蓝色光谱中的光激发，而橙色区域的辐射最强。因为凋亡细胞有很多被吞噬的酸性区室，这使得它成为这类细胞的常用标记物。

在神经元研究中，例如基因活动或细胞运动，了解细胞的离子浓度是很有意义的。钠、钙、氯或镁离子对许多不同的细胞活动有深刻的影响。通常，离子可以在荧光标记的螯合剂的帮助下被捕获，当与适当的离子结合时，螯合剂改变了它们的光谱特性。这原则是实现在钙指标Fura-2 indo-1 fluo-3 fluo-4而且Calcium-Green例如。

对于钠的检测，SBFI(钠结合苯并呋喃唑)或钠绿色是常用的。PBFI(结合钾的苯并呋喃苯酞)检测钾离子。

有趣的是，也有基于蛋白质的钙指标。其中一种是基于水母化学发光蛋白发光蛋白质．水马苷、发光团腔肠嗪、分子氧和钙的相互作用^{2 +}导致蓝光的释放-一个非常突出的机制荧光蛋白的发现．

以上提到的所有染料都列在下表中。此外，还提到了其他荧光染料及其激发和发射波长峰。

• 荧光蛋白-介绍和光光谱特性
• 荧光蛋白和荧光计时器
• 现代荧光蛋白及其生物学应用
• 荧光蛋白——从起源到诺贝尔奖