荧光蛋白 - 引入和光谱特性

荧光蛋白答:维多利亚

光谱特性绿色荧光蛋白或其变体位于形成的氨基酸结构中发色团(图1)。这可以是位于65-67位的三个氨基酸或靠近这个位置的残基(如YFP)。除了与发色团有关的主要突变外，还开展了其他位点定向突变的研究，以提高蛋白质在异体细胞系统中的成熟和表达等其他因素(如密码子使用、生理温度下蛋白质折叠)。请注意,答:维多利亚是一个相对原语的海洋生物，没有体内热系统。

即使绿色荧光蛋白是最受欢迎的FPS之一，因为它具有亮度和高的光稳定性，它具有两个主要缺点。这些对pH的一定敏感性和微小化的倾向。二聚或低聚是许多FPs的问题。它们相互凝集的偏好可能产生有关融合蛋白的位置和功能的人为因素或误解。但科学家们也找到了这个问题的答案。在非极性氨基酸被亲水氨基酸取代的关键位置(F223R, L221K和A206K)突变显示二聚作用减少。在“增强型”FPs的名义下，对所有导致光谱和实际特性改善的遗传变化进行了总结。

在wtGFP的情况下，增强导致egfp.(增强绿色荧光蛋白)，在488 nm处有一个单一的激发峰，而不是先前在395 nm和475 nm处的络合物吸收光谱。Roger Tsien等人开发的wtGFP的第一个突变版本(S65T突变)比原来的亮5倍，成熟时间更短。再加上基于另一种突变(F64L)在37°C下的更好的成熟效率，这对人们研究活细胞起到了重要作用。

一个非常有趣的绿色荧光蛋白具有最大的斯托克斯之一的变体是蓝宝石．在靠近发色团的位置(T203I)发生突变后，激发最大值变为399 nm，发射最大值变为511 nm。这是112纳米的斯托克斯位移。翡翠是另一个绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞中修饰以提高光稳定性和亮度和更有效的折叠。

虽然所有绿色荧光蛋白质具有相对高的亮度，但蓝色荧光蛋白通常患有显微镜应用中的发光强度降低。然而，由于其他光谱性质，它们用于光学测定。EBFP经多次突变wtGFP，构建了增强型蓝色荧光蛋白(Enhanced Blue Fluorescent Protein)。第一个(Y66H)从绿色跃迁到蓝色光谱。随后发生了更多的突变，产生了在380 nm处激发最大，在448 nm处发射最大的蛋白质。这些光谱特性使它成为EGFP的合作伙伴烦恼显微镜。最近的蓝色荧光蛋白具有更高的量子产率和光稳定性蓝铜矿那SBFP2和EBFP2.．一个有前途的EBFP继任者是一个名为的蛋白质天狼星由于其对pH值的高耐受性(pH值在3-9时稳定)和迄今为止发射波长最短的荧光蛋白的声誉而流行。

第二“蓝色”类绿色荧光蛋白变异由青色荧光蛋白形成:cfp．色氨酸(Y66W)取代酪氨酸和进一步的基因改变导致荧光色素的亮度和光稳定性提高。该ECFP在433/445 nm和475/503 nm处有双峰激发和发射光谱。亮度仅为EGFP的40%左右。一个突出的ECFP变体是蔚蓝的，具有较高的消光系数和量子产率。它的亮度是ECFP的1.5倍，被用作烦恼与YFP合作。

一种绿色荧光蛋白不直接改变发色团中的三种中央氨基酸中的一种的突变导致黄色荧光蛋白的升高。YFPs在203位有一个共同的苏氨酸，由酪氨酸交换(T203Y)。这个氨基酸是β-桶的一部分，在发色团附近。相比绿色荧光蛋白，激发和排放性能已经在514nm和527nm（Eyfp）中具有激发和发射最大值的较长波长。EyFP的一个特征是其pH敏感性。在pH 6.5 EYFP中只有约50％的荧光，这并不总是一个缺点。当讨论pH测量时（例如囊泡，内囊体等），EYFP可用作指示剂。有趣的是，进一步的突变（Q69M）开发出更好的酸稳定性，并且显着改善亮度（比E​​GFP比EGF更亮75％）。与EGFP相比，这种蛋白质仍然具有差的光稳定性，被称为黄水晶．另一个YFP突变体（F46L）显示出速度更快的成熟速度和改善的pH抗性。这个蛋白质被命名金星并且是一个频繁的烦恼有erulean的受体。

在《Anthozoa》中发现的第一款也是最常用的FPs便是安全域．这个名字来自海葵Discosoma striata．DsRed的激发峰在558 nm处，发射峰在583 nm处。然而，当结构信息公布时，最初的欣喜停滞了。DsRed比水母FPs成熟得慢得多，并且有一个中间发色团阶段。这个阶段发出绿色光谱的光，并导致与其他FPs重叠。正如在绿色荧光蛋白部分，DsRed也有另一个问题。红色荧光海葵蛋白是一种专性四聚体，易于形成低聚体。这可能导致对融合蛋白的位置和功能的误解。一般来说，Anthozoa FPs的结构与Aequorea FPs相似。发色团隐藏在4 nm × 3 nm(高×直径)的β-桶状结构中。不同之处在于anthophya β-barrel的外观更椭圆形(图2)。

与之平行绿色荧光蛋白在“进化”中，研究人员开始修改原来的DsRed，以克服其结构缺陷。第二代红色-DsRed2-具有较低的低聚物形成趋势和较快的成熟速度，最大限度地减少绿色光发射中间阶段。进一步的突变导致红色FP完全失去了四聚体的地位，但也丧失了部分量子产率(DsRed2的25%)。Tsien等人的这项工作是第一个单体红色荧光蛋白，因此被称为mRFP1．

这个mRFP1是创建一组6个单体FPs的起点，这些单体FPs统称为“mfruit”．他们的个别名称来自他们的排放颜色：Mhoneydew，Mbanana，Morange，Mtangerine，Mstrawberry和MCherry。mCherry是这些FPs中最有用的，其发光范围为610 nm，亮度为EGFP的50%。

迄今为止最聪明的FP是mFruit派系的追随者，并有这个名字tdTomato．就遗传改变而言，Dtomato是一种迫长的二聚体。但是通过将两种分子中的二聚化伴侣放入一个分子中，避免了二聚化。两个二元单元由12个氨基酸接头偶联，产生串联二聚体FP TDTOMATO，在581nm处产生最大值，并且在最高区域中具有光稳定性。

当另一个mFruit继承者被创建时，发射光谱进一步移到远红光区域(630 nm - 700 nm)。mPlum是所有mFruit蛋白中在649 nm处红色发射最深的mFruit成员。

科学上使用的绿色荧光珊瑚虫蛋白的数量是非常小的，这并不非常令人惊讶，鉴于众所周知和用户友好的可用性答:维多利亚绿色荧光蛋白．显然，人们认为没有必要建立一种新的绿色荧光蛋白。尽管如此，还是有一些，比如石珊瑚上的一种明亮的荧光蛋白Galaxeidae.那Azami绿色．有趣的是，它与EGFP的序列同源性小于6%。

一种对深部组织成像有重要影响的珊瑚虫FPKatushka．应用诱变对来自的RFPE. Quadicolor.，Katushka被鉴定为二聚体蛋白质，最大值为635nm，最高亮度水平，所有深红色荧光蛋白。称为Katushka的单体形式mKate后来亮度更高，结果MKATE2.．

总之，今天显微镜下使用的所有荧光蛋白都来自原始海洋生物。表1包含了最重要的光谱及其相关的光谱特性，如激发和发射最大值，光稳定性，量子产量和亮度。