高级定量荧光显微镜，探讨病毒进入的分子动力学

将病毒进入宿主细胞需要以精确的顺​​序协调病毒和细胞蛋白以引发膜融合。在这里，我们提出了来自艾滋病毒研究领域的两个例子，以展示先进的共聚焦显微镜技术如何能够在活细胞中启动艾滋病毒融合事件的时间解决的化学计量分析[1]以及荧光寿命成像(这部电影）有助于了解对主机的感染变化。通过分子记者实现该结果，其给出细胞内生理变化的荧光读数。今天的新一代共聚焦显微镜 - 具有执行终身的成像的能力 - 已经有助于在同一实验中使用多种荧光生物传感器。应用这部电影转至Förster共振能量转移(烦恼）确定还允许收集更多的定量数据。这种方法在阐明病毒性易感性中的作用以及随后对细胞代谢的后期感染后效应的作用非常有效[2]．

掌握病毒进入机制

HIV进入免疫细胞，例如巨噬细胞和T细胞，需要一种复杂的和协调的细胞反应，其通过与细胞表面受体的相互作用而引发。由于糖蛋白尖峰的刚性，未成熟的HIV颗粒无法进入宿主细胞[3]．在变得具有传染性之前，病毒颗粒需要Gag蛋白被切割。这一步骤使结构重组成为可能，导致病毒受体结合蛋白Env在病毒膜上的流动性。一旦Env蛋白能够自由移动，它们就能够在膜中形成Env三聚体，从而提供宿主膜融合所需的功能膜簇(详情参见Jakobsdottir等人2017年的综述)。［4］．病毒糖蛋白和宿主受体之间的相互作用是决定有效感染事件的关键起始步骤。因此，对这一感染过程的分子机制有更全面的了解是非常必要的，因为它可以用于开发新的干预策略来防止病毒感染。

通过定量光子计数和荧光寿命信息获得洞察力

荧光寿命成像显微镜（这部电影/猎鹰［5］“基于光子计数的预先分析是测量分子动力学和机制的所有强大技术。恒星平台引入的光子计数的最新进展增加了进一步辨别光子事件的能力，提高了测量荧光的保真度［6］．利用基于荧光寿命的信息来区分同一实验中的多个生物传感器是阐明病毒入侵复杂、多阶段、机制的有效手段。目前在STELLARIS平台上的共聚焦显微镜技术的最新进展允许在共聚焦显微镜上捕获荧光寿命信息［5］那［7］．这部电影还能用来测量吗烦恼这是理解分子间动态空间关系的一项重要技术。这部电影-烦恼是黄金标准技术，因为它提供比其他更强大和数量的数据烦恼方法，例如敏化发射或光漂白。

实时跟踪单个粒子和分子

在研究病毒进入时，重要的目标是了解病毒粒子如何与宿主细胞进行物理相互作用。显微镜技术现在已经前进到了可以分析分子水平的这些相互作用的程度。在荧光显微镜实验中的任何给定的照明体积内，给定分子的最大荧光强度与该分子的总数成正比［8］．另外，强度波动的相应幅度将根据分子是否处于单体或二聚体状态而变化[9]．这些波动需要时间分辨的显微镜技术来精确地量化它们。利用这些信息，有可能追踪单个病毒粒子以及细胞表面的单个分子，以获得病毒受体和辅受体结合的精确化学计量图。

特别是存在三种显微镜方法，这是实时研究病毒的关键：

1. 单病毒粒子跟踪(SVPT) -单个病毒粒子的跟踪，并监测其与宿主细胞受体的时空相互作用。病毒粒子跟踪被用作细胞分析的锚点。它还允许将与粒子跟踪无关的细胞信号用作内部控制措施。
2. 数字和亮度(N&B)［6］-［8］-利用荧光相关光谱技术实时监测荧光信号随时间变化的波动，以确定给定蛋白的低聚态(FCS.）。该信息用于评估病毒宿主交互所涉及的每个受体的数量。
3. 互相关n和b (ccN&B)[10]那[12]- 来自两个荧光标记的蛋白质的信号的正相关性是蛋白质 - 蛋白质相互作用或蛋白质复合物形成的标志。N＆B读数的互相关使得跟踪宿主受体是否在感染期间彼此相互作用，也给予化学计量。这种相互作用是病毒引起的信号级联的起始点。

使用基于定量的荧光强度的信号构建HIV进入的详细图片

Iliopolou等人发表在《自然结构与分子生物学》杂志上的一项研究使用这些方法揭示了艾滋病毒与宿主细胞膜融合的动态过程[1]．在整个融合过程中，HIV-1 Env蛋白主要与单个CD4分子和一个CXCR4分子结合，受体和辅受体相互作用，以及HIV-1 Env三聚体。在初始复合物形成后不久，观察到CXCR4二聚。值得强调的是，HIV的共受体是GPCRs，这种二聚化步骤可以作为触发细胞信号的点，从而促进宿主侧的膜重组和融合。CXCR4二聚“作为HIV粒子的锚点，更多的CD4分子被招募到细胞表面形成一个大的复合物。该蛋白复合物的额外重排有利于反应的稳定和共受体的置换，从而使病毒粒子融合并进入宿主细胞所需的六螺旋束形成[1]．Iliopolou等人的工作显示了X4和R5热带病毒的特定时空机制。他们的数据表明预融合复合体的形成有3个步骤。这个时间解析的视图，加上迄今为止发表的不同的HIV糖蛋白晶体结构，使研究小组能够构建出HIV进入过程中机制的详细图像[1]．

病毒入侵的另一个重要方面是它的异质性。即使在研究基因相同的细胞培养时，也经常观察到，并不是种群中的所有细胞都容易在同一时间受到特定的传染性病原体的感染。这种现象在许多不同的病毒病原体上都观察到了，包括HIV-1。还有一些研究表明，代谢途径和重要的t细胞功能之间存在明确的联系［13］那[１４]，这些观察结果导致了一种假设，即细胞的代谢状态对病毒进入有影响[2]．当使用2-脱氧葡萄糖来破坏细胞代谢时，病毒感染细胞的百分比也降低。

光学生物传感器和寿命成像使更深入地探索病毒进入的分子机制

发现细胞代谢和病毒易感性之间的这种相关性仅是冰山的尖端。直到可用性的高级成像技术，即它可以破译潜在机制。一个核心问题仍未得到解决：病毒改变细胞代谢，或者在细胞代谢驱动感染热点中的异质性吗？[2]．为了解决这个问题，研究人员已经提出使用各种荧光探针和光学生物传感器，以检测和关联的不同参数对病毒进入重要的，如代谢活性，病毒融合事件和局部膜张力的。所有这些生物传感器使用时间分辨技术监测，这对于获得动态生物过程的洞察，例如病毒入口是必不可少的。寿命成像允许在同一实验中使用的多个生物传感器以及在此情况下产生更强大和可量化的数据这部电影-烦恼［8］．

代谢活动传感器

一般代谢生物传感器，如感知使用绿色荧光蛋白［15］可以通过测量ATP/ADP比值给出细胞能量状态的光学读数。ATP的含量反映了细胞中储存的能量，而ADP的含量则随着各种代谢反应中能量的消耗而上升。因此，两者的比值可以很好地反映细胞内的代谢活动。使用这些试验结合荧光标记的病毒颗粒追踪探针，很容易看到病毒颗粒和代谢活性细胞之间的相关性。这种方法比较广泛，不能提供关于病毒进入和代谢如何相互关联的详细信息。

病毒融合生物传感器（IBLAM）

关于病毒颗粒和宿主细胞的相互作用的更多细节可以通过使用在融合时提供光学读数的记者来揭示。一个很好的例子是IBLAM记者，其中β-乳酰胺酶-VPR嵌合蛋白质包封在HIV衣壳中。如果发生融合事件，则β-乳酰胺酶-VPR进入细胞并切割染料CCF2，使其发出不同波长的光。该读数也可以受益于荧光寿命测量［16］．

膜张力生物传感器

有许多创新的生物传感器系统可以提供有关主机的状态的时间解决的信息。当这些被引入感染模型时，它们可以迅速产生进入感染过程的新颖洞察力。A.烦恼基于生物传感器用于给出一个光学，定量读数的局部张力在细胞膜［17］其中HIV颗粒是结合的。生物传感器分别基于与林和克拉斯序列连接的ECFP-yPet对［17］．荧光寿命信号的变化可以指示荧光蛋白在有序和无序的膜基序之间拉伸的程度，而这反过来又与膜张力相关。数据显示，当HIV粒子结合时，膜张力局部下降。这种下降可以通过用2脱氧葡萄糖处理细胞来防止，它也可以通过抑制糖酵解和减少膜上可用胆固醇的数量来阻止病毒进入。在这种情况下，膜秩序下降，张力增加，最终阻止病毒进入[2]．

结论

在此引用的研究突出了艾滋病毒研究中所做的一些主要进度，并且可以应用于艾滋病毒生命周期甚至其他病毒的不同阶段的动态过程的研究。这里讨论的是用于研究对病毒进入研究相关的代谢和膜张力的荧光探针和生物传感器。然而，有更多的生物传感器可用于血清血管过程。最近的数据库已发布，可以为实验设计提供一个很好的起点[18]．找到合适的人将取决于用实验测试的假设。考虑到与共聚焦平台的生物传感器有多合适也很重要。在同一实验中结合多种生物传感器的能力，以及使用基于寿命的信息的能力烦恼和其他基于荧光的系统，允许从复杂的多步宿主病毒相互作用中获得新的见解。

现代共聚焦平台及其灵敏的光子计数探测器使单分子事件的可视化和定量以及对分子水平上的实时快速变化的研究成为可能[1]那［6］那[10]．荧光寿命成像技术的进步使研究人员能够从光学生物传感器中受益，并获得驾驶艾滋病毒进入和感染的分子过程的更深层次的理解[2]那［5］．最终，该技术将有助于研究人员开发旨在瞄准疫苗所需的艾滋病毒感染的基本方面的新干预策略。此外，这种方法可以推广用于研究其他已知和新出现的病毒病原体。