工作更有效地在发育生物学与立体显微镜:斑马鱼,青鳉、非洲爪蟾蜍

上述提到的三种水生生物模型、斑马鱼、青鳉,非洲爪蟾蜍,通常用于分子和发育生物学。成年斑马鱼如下所示。

在分子和发育生物学,这些水生脊椎动物生物模型广泛应用于研究分子过程的发展和疾病模型。感兴趣的分子机制,研究这些蛋白质荧光标记,观察到发展中生物在细胞或亚细胞水平的几小时或几天[4]。

这里描述这三个生物模型可以很容易地在实验室培育和维护,有短的生命周期,是转基因的。这些修改的例子是一个基因的删除(淘汰赛)或引入基因敲入。如果一个外源基因引入基因组,结果是一个所谓的转基因生物。下面,我们将重点讨论这个方法[5]。

此外,斑马鱼也有一个特定的特征使他们有用的发育神经科学:斑马鱼的幼虫是半透明的活动在开发过程中可以同时测量多个神经元[6]。

有三种常见的步骤做日常工作时aquaticmodel生物,如斑马鱼:

• 转基因技术
• 荧光检测
• 功能成像。

每个工作步骤的详细描述在下面的部分。高效、可靠的显微镜需要这些。这一系列的步骤将被称为“工作流”在这个报告。

大多数国家都有定义良好的动物安全规定当用于科学实验。瑞士也有这样的规定[7]。遵守这些规定,有利于有效和快速的筛选转基因胚胎和成年斑马鱼的rapidprocessing生成胚胎。

作为单独的成年斑马鱼不能永久地标记,至少目前,雄性和雌性杂交,来评估他们的胚胎而筛查基因转移,需要保存在个人控股坦克,直到他们的胚胎研究的很透彻了。更快的胚胎的特征可以确定:

• 成年人可以越早放回适当的住房坦克
• 单独的坦克的数量,和工作人员的工作量,可以最小化
• 和只斑马鱼能够保持理想的特点,避免了不必要的需要保持大量的实验工作。

快、准确描述的斑马鱼胚胎会导致一个更高效,既能维护这些生物模型的有效方法。

有两个关键因素胚胎快速和准确的描述:

• 高效的有时朦胧发光转基因荧光检测
• 和一个高效、方便的成像方式的胚胎筛选。

实际上,荧光显微镜检测微弱的开花信号,让他们看到的眼睛在一个简单的方法是实现这个目标的最佳工具。

转基因技术

在斑马鱼基因改造、青鳉和非洲爪蟾蜍通常由显微镜下注射DNA, RNA或染料(至于质粒,mrna、吗啉代siRNAs,等等)。[8]。这些操作是有效的支持的光学放大实现用立体显微镜,徕卡M50、徕卡M60或莱卡M80[9]。如果DNA注入细胞和包含到基因组(转基因),这导致一种转基因动物。

荧光检测

作为生物体发育成幼虫阶段,成功的集成(基因组)和转基因的表达是评估。转基因是一个基因的一部分荧光蛋白,如绿色、红色或黄色荧光蛋白[10]。因此,筛选潜在的转基因幼虫通常是用荧光立体显微镜,徕卡等MZ10 F[11]、徕卡M165 FC或莱卡M205足总[12]。

功能成像

功能成像的一个例子是通过Ca电生理学的研究^{2 +}在各种类型的细胞信号。注入的生物合成^{2 +}指标[13],经常使用显微操纵器,使研究神经元和神经胶质细胞的神经活动。钙指标也可以在完整的基因表达和成像或semi-intact生物由于发展中斑马鱼幼体的半透明性质。这些实验经常使用多光子荧光显微镜[14]。

在开发期间,生物往往与立体显微镜成像,在某些情况下,操作和执行进一步的实验做准备。只需要一个2 d视图时,执行成像使用宏观、徕卡Z6等7月和徕卡Z167月[15]。对于高分辨率观察转基因,XFP-expressing(三个或三个以上同时荧光蛋白)[16]生物体或应用准备,宏观或共焦,多光子,lightsheet显微镜,徕卡等TCSSP8系列[17]是常用的。

斑马鱼的照片实验室(Mosimann实验室,iml)显示几个立体显微镜。

转基因技术

当生成基因转移,重要的是使用一个透射光想象鸡蛋的内部结构。尽可能多的鸡蛋必须注入为了获得一些“创始人”,转基因成功纳入生殖细胞系,注射通常需要几个小时,这使得一个轻松的姿势非常重要的工作。在注入步骤中,重要的是安排在显微镜下鸡蛋,这样运营商有良好的概述,让他/她将在一个快速和有效的方式。最后,一个大型显微镜基地允许研究人员移动几个盘子边缘他们摔倒的风险较小。典型显微操纵器,如莱卡操纵者[18],埃普多夫InjectMan倪2,或者使用Narishige mmo - 220 a。常用的喷油器ASI MPPI-3,股份FemtoJet和帕克Picospritzer几个例子。

• 大视场(FOV) /对象字段(的)(查看区域)→目镜的视场直径(FN) 23可用在视场给增加了20%或更多,而那些FN 21岁或更小;
• 少关注查看样品/样本→时需要大景深低倍镜下;
• 最大分辨率1.6μm(数值孔径(NA)的0.21)与徕卡M80最大分辨率2.2μm 0.15 (NA)和徕卡M60徕卡M50;
• 高质量的图像消色差或计划消色差的目标[21];
• 紧凑设计→小足迹显微镜可以融入一个有限的空间;
• 增加舒适和生产力:更少的使用集中驱动可调力矩时肌肉拉伤→根据显微镜系统的整体重量,聚焦旋钮的扭矩可以适应用户的偏好;
• 避免疲劳,因此模块→使用户能够保持更好的工作;
• 清洁和紧凑的整体设置仪表→电缆集成到重点列的相机,照明,电动的焦点。

• 多才多艺的对比方法:brightfield和片面的暗视野照明;
• 移动多个样品/样本容易手的和更多的空间目标在操纵和排序,在解剖标本放置→大型平面;
• 操作简单,适合常规应用。

• 多才多艺的对比方法:非常均匀brightfield,优化Rottermann对比和低反射暗视野;
• 容易处理,工作速度和节省时间,自动光圈调整自动变焦光学实现最佳对比;
• 研究整个有机体与高精度大视场(FOV)多达65毫米直径;
• 其工作在一个标本和处理更容易操纵,非常平坦,符合人体工程学的LED灯基地;
• 由于完整的编码使用徕卡应用程序套件(再现性拉斯维加斯),拉斯维加斯X软件[22];
• 明亮、均匀和中性色彩照明强度的独立——最新的LED技术成为可能。

虽然荧光蛋白的生物工程有几种增强绿色荧光蛋白变异,有可能是理想的转基因表达水平较低。这个低级表达式可以是由于生物过程和技术问题。由于这些原因,荧光检测灵敏度可以发现和失踪转基因生物的区别正确表达转基因。此外,正如上面提到的,重要的是高效、准确的斑马鱼胚胎特征表征有效的荧光检测的转基因疲软的信号。

在筛选和鉴定的发展中斑马鱼,常常需要比较生物相同的照明和光学显微镜设置。因此有必要存储这些设置简单,高效的回忆和确保再现性。理解转基因斑马鱼的荧光模式,它可以相当抽象,隔离,通常需要荧光和传播照明之间转换的基础。显微镜控制器的编程,如莱卡SmartTouch或脚踏板,和使用一个编码与透射光显微镜基础,如莱卡M165 FC或莱卡M205 FA与徕卡TL5000因此,简化这个任务非常。它还支持快速评估胚胎细胞的位置和方向后荧光成像。

当观察非常微弱的荧光信号在实验期间,重要的是要消除或最小化尽可能多的背景自发荧光来自容器的材料的动物成像,通常一个培养皿。涉及多个商业供应商的一个广泛的搜索后,Mosimann实验室发现塑料培养皿以最小的自体荧光,足够硬质塑料,well-closing盖子,一个有利的价格。这些培养皿的组合与一个特殊的程序准备他们消除污染导致最小的背景在实验观察自体荧光。更多细节关于这些可以从Mosimann获得实验室培养皿[4]。

徕卡M125[23]与荧光模块(徕卡EL6000立体显微镜[24]外部荧光源)或徕卡MZ10 F[11]荧光与徕卡TL3000圣立体显微镜[20]透射光基础:

提高流程效率与徕卡MZ10 F

• 很好的分辨能力(max 1.33μm)高数值孔径(max NA = 0.25)和10:1变焦范围;
• 强烈的荧光照明和最高的荧光信噪比(S / N)比例与TripleBeam技术[25];
• 高质量的图像消色差和计划复消色差的目标与计划[21];
• 四工位快速过滤器改变系统(FLUOIII);
• 各种各样的标准和自定义过滤器几乎任何荧光技术;
• 用户保护紫外线辐射;
• 各种各样的目标和配件可用

徕卡M165 FC荧光立体显微镜(中档)与徕卡TL4000 RC / RCI透射光基地和M205足总[12]荧光立体显微镜(高端)与徕卡TL4000 RC / RCI或莱卡TL5000因此[20]。

• 最好从总体到细节用变焦光学放大范围的16.5:1、20.5:1;
• 最高的荧光信号噪声(S / N)与TripleBeam比率[25]技术;
• 0.3分辨率下降到1.10μm (max NA)与徕卡M165 FC和0.96μm (max NA 0. w35)与徕卡M205 FA;
• 达到最高的分辨率和景深目前可能观看3 d图像用立体显微镜→FusionOptics[26]与徕卡M205 FA可用;
• 高质量的图像消色差或计划复消色差的目标与计划[21];
• 可再生的结果很容易由于仪器编码;
• 扭曲的自由观察沉浸或嵌入式标本与徕卡计划7月2.0 x CORR目标可以消除折射率不匹配[27];
• 完整的舒适性和易用性做复杂的实验时完全自动化的徕卡M205 FA;
• 四工位快速过滤器改变系统(FLUOIII);
• 各种各样的标准和自定义过滤器几乎任何荧光技术;
• 各种各样的目标和配件可用。

功能成像通常包括电生理神经活动的调查和研究,通过实验利用Ca^{2 +}信号或生物体的解剖。由于斑马鱼幼体的半透明性质,这些类型的实验通常使用多光子荧光显微镜(6、14)或共焦显微镜[17]。解剖,成像通常使用立体显微镜完成。功能成像的一些例子如下所示。

斑马鱼(鲐鱼类)[1]青鳉鱼(Oryzias latipes)[2],非洲爪蟾(非洲爪蟾蜍光滑的)[3]水生生物模型通常用于发育生物学研究。

斑马鱼的日常工作流程,青鳉鱼,或非洲爪蟾涉及多个步骤使用立体显微镜:

• 转基因技术,将DNA注入生物体的鸡蛋来生成“创始人”;
• 正确的转基因表达的荧光检查,观察幼虫找到“创始人”
• 功能成像,描述稳定的转基因线较低或高分辨率显微镜,或研究电生理学和神经活动。

转基因技术通常是用立体显微镜和荧光立体显微镜鉴定转基因线。高分辨率成像获得亚细胞的细节,电生理学、或神经活动,共焦或复合使用显微镜。

这份报告是指科学家和技术人员与水生生物模型的例子,显示了不同的可能的设置与大范围的显微镜及配件。因为每个实验室的要求可以差别很大,一个大范围的配置和工具可用来解决特定任务的工作流,甚至使更多的工作步骤是由一个乐器。这个简短的报告提出了工作流基于不同实验室的经验和建议可以是一种非常有用的参考或指导,以建立或扩大使用斑马鱼发育生物学实验室,青鳉鱼,或小非洲爪蟾。

1. 鲐鱼类、连接:www.FishBase.org
2. Oryzias latipes,连接:www.FishBase.org
3. 非洲爪蟾蜍光滑的,连接:www.amphibiaweb.org
4. Mosimann实验室,分子生命科学研究所(iml),瑞士苏黎世大学
5. 生物模型,引用维基百科,尤其注意:指85 - 87年上市这一页斑马鱼和非洲爪蟾蜍
6. Borlinghaus RT:神经科学和显微镜:有益的伙伴关系,连接:科学实验室
7. 动物实验中,瑞士联邦食品安全和兽医办公室(FSVO),连接:www.blv.admin.ch
8. DNA,维基百科;RNA,维基百科
9. 小册子,徕卡M50、M60 M80
10. Greb C:荧光蛋白-介绍和照片的波谱特性,连接:科学实验室
11. 小册子,徕卡MZ10 F
12. 小册子,徕卡M165 FC, M205足总
13. 钙成像,维基百科
14. 具有:多光子显微镜对深层组织成像原理,连接:科学实验室
15. 小册子,徕卡Z6 APO, Z16 APO
16. Livet J, Weissman助教,康H,草案RW,陆J, Bennis RA, Sanes——JR和李奇曼JW:转基因策略组合表达荧光蛋白的神经系统,连接:www.nature.com,自然450:56 - 62(2007年11月)
17. 118金宝搏app下载
18. 徕卡显微操纵器产品页面
19. 小册子,徕卡S8朊
20. 宣传册、徕卡TL3000 TL4000 TL5000
21. 目标类,徕卡产品页面
22. 宣传册,徕卡LAS X软件
23. 小册子,徕卡M125, M165 C, M205 A和C
24. 徕卡埃尔6000产品页面
25. Fuchs B:立体显微镜TripleBeam技术第三在荧光显微镜照明路径更好的信噪比,连接:科学实验室
26. Goeggel D, Schue, kip D: FusionOptics——结合了高分辨率和景深理想的三维光学图像,连接:科学实验室
27. DeRose JA和Bürgers H:如何正确的在立体显微镜通过使用正确的客观的镜头畸变消除液体折射率不匹配或嵌入式样品/样本,连接:科学实验室