美国flexneri是人适应大肠杆菌获得侵入结肠粘膜（大肠膜衬里）的能力的细菌，引起炎症和脑痢疾病。这种病原体的细胞内的生活方式已经很好地研究过体外和志贺丽最近获得承认作为炎症范式来研究宿主先天免疫。然而，在痢疾的天然小鼠模型缺乏的情况下，体内研究志贺丽发病机制（导致疾病的机制）受到限制[1]．

M. Marinum.是一种天然鱼类病原体，导致宿主组织中肉芽肿性坏死病变（来自炎症的组织损伤）。这些病变是组织学上类似的结核分枝杆菌，人类结核病（TB）的致病剂。再次，缺乏一项完全重新承载这种疾病的小鼠模型，以及与学习相关的人类健康风险结核分枝杆菌这使得有效研究结核病变得困难体内．为此，我们M. Marinum.- 了解潜在的分枝杆菌感染的核心机制是一种极具贵重的替代品[2,3]．

非哺乳动物模型在理解各种疾病(感染、癌症、神经退行性变)和开发改善人类健康的治疗方法方面一直很重要。特别是斑马鱼是一种脊椎动物模型，它在基因、发育和生理上都与人类有着显著的相似之处［4］．斑马鱼是高度融合，外部受精，生命周期短。从实际的角度来看，这些特征意味着大量胚胎被易于和始终如一地获得研究。此外，斑马鱼的幼虫阶段是天然半透明的，提供了可视化和解剖的独特机会体内转基因幼虫荧光细胞的行为。特别是，感染模型可以受益于斑马鱼线与荧光标记的免疫细胞，使体内白细胞成像（白细胞：巨噬细胞，中性粒细胞）及其在炎症和传染病中的作用。

在这里，我们使用美国flexneri和M. Marinum.斑马鱼感染模型研究中性粒细胞招募感染体内．转基因幼虫感染期间荧光标记的细菌的实时成像显示出高度病原体特异性中性粒细胞募集。令人惊讶的是，虽然我们观察到快速和强大的中性粒细胞招募美国flexneri感染，类似剂量M. Marinum.没有刺激对受感染的部位的显着中性粒细胞迁移。这些数据突出了Live成像的值，以使得能够对细菌感染的理解。

斑马鱼护理和维护

所有实验均在自由取食阶段之前，在受精后(dpf) 5天以内的斑马鱼幼体上进行。因此，这里报道的实验都不属于英国和欧盟的动物实验规定。根据欧盟处理实验动物的指导方针和1986年伦敦帝国学院动物(科学程序)法案，饲养的成年鱼得到了维护。所有实验和程序均由内政部批准(项目许可:PPL 70/7446)。卵通过自然产卵获得，如前所述，在含有0.5X E2胚胎培养基中添加0.3 mg/ml亚甲基蓝的培养皿中清洗和保存。显微镜观察，胚胎培养基中添加0.003% 1-苯基-2-硫脲在受精后24小时(hpf)，以防止黑色素合成。图1显示了伦敦帝国理工学院的斑马鱼拘留设施。

细菌制剂

本研究中使用的细菌菌株是：

1)野生型(wt)美国flexneri(M90T菌株)表达mCherry(红色荧光蛋白);

2) WtM. Marinum.（m菌株）表达麦克里［5］．

对于斑马鱼幼虫的显微注射，通过离心，洗涤，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以所需的浓度（〜500 cfu / n1）来收获细菌。

斑马鱼幼虫的细菌感染

对于注射程序，用200mg / ml三胞嘧啶麻醉幼虫。在3 dpf，定位在琼脂糖注入板上的幼虫被微量内注射到Hindbrain脑室（HBV）中，其中1nL（〜500 cfu）美国flexneri或者M. Marinum.细菌悬浮液或干净的PBS溶液作为对照。注射用im300微注射器(Narishige)和aM80立体显微镜（Leica Microsy188金宝搏的网址stems）如前所述［6］．接种物被证实后验通过注射到一滴PBS和细菌电镀。图2a-b显示细菌和幼虫制备和微量注射的实验室设施。

斑马鱼幼虫的实时成像

斑马鱼乙肝病毒是高度易于成像，并使注入的致病菌和白细胞可以跟踪一段时间。为了对注射部位的中性粒细胞招募进行体内成像，将麻醉后的斑马鱼幼虫定向固定在1%低熔点琼脂糖中，并用含有三卡因的0.5X E2培养基覆盖。亮场和荧光宽场成像采用M205足总荧光立体显微镜（Leica Microsystems）。188金宝搏的网址多个字段Z堆叠（多聚焦成像）以15分钟的间隔获取。自动阶段允许同时遵循几种动物（3 PBS注射对照幼虫，4米Marinum感染幼虫，5秒柔屈的幼虫）。图3A-C显示了成像幼虫的共同作者的2。

中性粒细胞量化

使用之前发表的Tg(mpx:eGFP)转基因斑马鱼系进行定量，中性粒细胞表达增强的绿色荧光蛋白eGFP[7]．将荧光立体显微镜拍摄的图像加工成电影，用ImageJ软件进行分析[8]．在感染后1和6小时的后脑中量化EGFP表达中性粒细胞（HPI）。通过Graph Pad Prism使用学生的T测试计算统计数据。

中性粒细胞是高度运动的先天免疫细胞，并且经常迅速响应入侵病原体。因此，中性粒细胞募集，吞噬作用和病原体破坏是对许多感染的初始遏制非常重要。我们在这里展示斑马鱼幼虫中性粒细胞显示出强烈的招聘美国flexneri．相比之下，M. Marinum.很大程度上避免了中性粒细胞的检测(图4a-b)。量化显示,美国flexneri注射的鱼显示在后脑脑室中的中性粒细胞数增加2.7倍，相对于对照鱼（仅限PBS），在6 HPI下已经1 HPI和3.0倍增加3.0倍（图5）。相比之下，中性粒细胞本地化M. Marinum.后脑室感染在1 hpi或6 hpi检测时间点与对照均无显著差异。

这些观察结果与之前的研究一致，研究表明美国flexneriHBV的感染可以引发各种炎症介质的激活，并诱导趋化性提示，激发患中性粒细胞(9、10)．另一方面，研究使用M. Marinum.乙肝病毒的感染已经证明趋化线索是微不足道的［１１］．数据表明，中性粒细胞仅在稍后，更先进和炎症的感染阶段与分枝杆菌相互作用，即在组织中形成肉芽肿（来自聚集巨噬细胞的炎症）。［１１］．在这种情况下，中性粒细胞被无法控制的死亡感染巨噬细胞产生的碎片吸引M. Marinum.感染。

不同的炎症和化学抑制剂特性年代。Flexneri.和M. Marinum.展示Host-pathogen互动的“微调”体内．志贺丽是一种肠杆菌，依赖于肠道上皮衬里的炎症性破坏，以侵入，生存和复制在其宿主内。炎症是由病原体分泌的毒力因子介导的。肠道上皮的侵袭随后是宿主的转录重编程，以产生趋化因子，例如有效的中性粒细胞引诱剂白细胞介素-8（IL-8）［12］．虽然中性粒细胞对细菌杀死很重要，但它们也可以破坏肠上皮，并且促进增加无法控制细胞的入侵志贺丽．

相比之下，M. Marinum.(类似于结核分枝杆菌）优先建立慢性感染。细菌掩盖其病原体相关的分子图案（PAMPs）在一层表面脂质下方，以逃避先天免疫识别的早期阶段［13］．众所周知，分枝杆菌可以通过复杂的机制(如诱导Ccl2和Cxcl11)在巨噬细胞内建立生态位，从而特异性地对巨噬细胞进行化学吸引(13、14)．在巨噬细胞生态位中，M. Marinum.可以在宿主体内复制并传播。播散的细菌形成肉芽肿病变，是分枝杆菌感染的标志，作为细菌保护屏障，减少了免疫细胞的进入［15］．

斑马鱼是一种新兴的模型生物志贺丽和分枝杆菌感染，并对我们对细菌的理解显着贡献体内．使用斑马鱼幼虫的感染，可以在高分辨率下成像细菌和宿主细胞之间的相互作用。在这里，我们利用透明斑马鱼幼虫的光学通道来研究相互作用美国flexneri和M. Marinum.与中性粒细胞(粒细胞白细胞)。这些观察可以帮助我们更好地了解宿主对重要细菌病原体的防御，并阐明控制人类细菌感染的新方法。

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