Ca２＋染料
离子敏感染料是可可逆地与特定离子结合的荧光分子。这些染料对荧光增强或减弱引起的离子浓度变化很敏感。离子与染料结合亲和力的量度是离解常数(Kd)。Ca越低２＋结合亲和力越高，Kd (Ca２＋)有两大类离子敏感染料：1。单波长染料，如Fluo3和钙绿，适用于非比例测量。发射的荧光强度与自由离子浓度成正比增加。2.双波长染料用于比率测量。这些指标也可分为两组：
双发射离子指标:
这些染料被激发在一个波长，并显示在他们的发射光谱的移动，结合特定的离子。这一组的一个众所周知和经常使用的指标是Indo1。
双激发离子指示剂:
这些染料在两个不同的波长上激发。发射的荧光强度随离子浓度的变化而变化。Fura2是最常用的比率Ca之一２＋指标。
Fura2
Ca２＋未结合态呋喃2在380 nm处被激发，Ca２＋结合形成于340纳米处。发射的光在510纳米左右测量。在340 nm处，随着Ca的增加，荧光强度增加２＋浓度，在387 nm处降低。有一些技术可以引入荧光钙２＋指示剂进入细胞，如酯负载，微量注射，化学负载技术或膜片钳移液管扩散。
有关不同Ca的进一步资料２＋指示物、染料处理、细胞标记和细胞装载，请参阅分子探针手册和Takahashi等人(见参考文献)．
比率测量的好处
由于染料分布不均匀、染料渗漏、光漂白和细胞厚度不等而产生的伪影可以通过比例法加以避免。在一个典型的实验中，你检测到Ca２＋随着时间的变化，必须进行校准。可在体外或体内进行校准。在体内校准时，最大和最小Ca的比例２＋浓度测量。这些值可以在同一实验中得到。的最大值２＋指示剂中可以加入离子载体如碘霉素或溴a2318来平衡钙２＋浓度。得到最小的Ca２＋浓度您可以使用EGTA缓冲溶液螯合所有钙２＋．
徕卡系统配置
系统必须配备外部滤光轮和EL6000光源。外部过滤轮包含特殊的激励过滤器，适用于Fura2在340 nm和387 nm。另外，你需要一个由二色分光镜和发射带通滤波器组成的滤光片来选择波长，最大波长为510 nm。
阅读更多关于如何设置广域钙成像实验的内容
阅读更多关于比率成像
比率成像需要一个专门的设置
工具书类
- Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY:新一代的Ca２＋荧光性能大大改善的指示剂。生物。化学。260(1985)3440-3450。
- 高桥A，卡马乔P, Lechleiter JD, Herman B:细胞内钙的测量。生理学Rev 79(1999) 1089。
- http://probes.invitrogen.com/handbook/