用于活细胞成像的方法
应用于活细胞成像的显微技术的范围也非常广泛。通常，细胞的生长、细胞聚集或细胞运动是通过使用复合显微镜和对比方法如相位反差和差分干涉反差(迪拜国际资本）。此外，较大标本的时间间隔成像，例如，开发斑马鱼胚胎，广泛进行，通常具有立体显微镜或宏观。高级荧光技术在过去几十年中变得越来越重要。共聚焦显微镜施用的快速增加已经改变了从平面到第三维的生物调查的视角。以下是常用技术的简短概述。
离子成像 - 观察离子浓度的变化
通常进行的方法是使用荧光染料或蛋白质的离子成像（钙，氯化物，镁），特别是在钙结合时改变其排放行为。这允许研究人员观察细胞离子浓度的动态变化。由于细胞细胞溶胶中的离子组合物决定了细胞的许多关键函数，如神经元的兴奋性，基因转录和细胞运动（仅对几个）的细胞内离子在空间和时间术语中的调节是对生命科学的重大兴趣研究。而且，具有特殊荧光染料的细胞内pH水平或电压的成像。一种用于成像离子水平，pH水平或电压的变化的特殊技术是比例成像方法。这些允许精确测定例如。细胞内钙浓度代替监测在非比例方法中的相对变化。
FRET -定量蛋白质-蛋白质相互作用
检测动态蛋白质相互作用烦恼（Förster共振能量转移）和BRET（生物发光共振能量转移）事件可以在Live-Cell实验中成像。烦恼是量化分子动力学的有用工具，例如蛋白质 - 蛋白质相互作用，蛋白质-DNA相互作用和蛋白质构象变化。烦恼成像通常使用衍生物绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白)，特别是CFP和YFP(分别为青色和黄色荧光蛋白)，它们都是利用分子生物学方法附着在感兴趣的蛋白上。然后用荧光灯激发CFP分子。一旦感兴趣的蛋白质在空间上接近(<20 nm)， CFP将作为供体，并将以光的形式发射的能量转移到YFP，而YFP则作为受体。研究人员将观察CFP发出的蓝色荧光向YFP发出的黄色荧光的转变。在BRET的例子中，供体是一个生物发光分子(例如荧光素酶衍生物)，作为供体，就像在烦恼那绿色荧光蛋白衍生物充当受体。
图1拟南芥共聚焦活细胞图像;endoplasmatic网:绿色荧光蛋白用红色的绿色，自发荧光叶绿体标记，蓝色传输。基于这样的图像。烦恼或者Frap.可以进行分析。
FRAP - 监测蛋白质和囊泡贩运
通常施用用于监测蛋白质或囊泡贩运的方法是光漂白后的荧光回收（Frap.）。这里是荧光蛋白（通常绿色荧光蛋白)附着在感兴趣的蛋白质上(例如，要监测其运动的蛋白质)。通常，整个细胞最初是荧光的，因为蛋白质可能在整个细胞中丰富。然后细胞的某个特定区域，通常是神经元细胞的轴突或树突，暴露在高强度的光(通常是激光)下，这个特定区域的荧光被破坏(褪色)。当感兴趣的蛋白质移动时，来自细胞其他部分的蛋白质将以一定的速度重新侵入漂白区域，漂白区域的荧光恢复。这可以让研究人员深入了解细胞内运输动力学。
观察接近细胞膜的过程
用于观察位于细胞的血浆膜中或靠近或靠近细胞的膜的事件的特殊技术TIRF(全内反射)显微术。利用荧光染料激发的倏逝场只穿透细胞60-250 nm，TIRF显微镜提供无与伦比的Z分辨率，该Z分辨率使得能够成像在血浆膜（例如分子输送到质膜）中发生或靠近血浆膜的成像，而不通过来自细胞内部的分子的荧光来外交。
TiRF图像：沿肌动蛋白长丝靠近膜的Galectin-3囊泡的运输。
PhotoCtivation - 监测基因表达和蛋白质运输
最近开发的方法称为PhotoCtivation选择性地标记了细胞或整个生物体内的某些区域或感兴趣的区域。用于光激活，特别是设计染料或荧光蛋白，如光活化的绿色荧光蛋白（PAGFP）或KaEDE。这些荧光团在正常状态下不是荧光。然而，在用某些波长的光照射之后，可以使这些荧光团被激活以荧光荧光团。在许多情况下，这些蛋白质是遗传融合到某些感兴趣的蛋白质中，然后可以监测其表达或转运。方法Frap.然后可以应用颗粒跟踪以进一步研究感兴趣的蛋白质。
MPE - 深度调查过程
现代生物研究需要实际研究，以补充“准invo”，在细胞培养实验中补充“准体内”。但很难调查像鼠标这样的生物体中发生的过程。多光子励磁（MPE.由于近红外激发光具有更长的波长，与用于单光子激发的短波长的光相比，它的散射更小，显微术能够更深入地穿透组织。非线性的本质MPE.技术限制了对焦中的地区的光噬和光毒性。这对长期调查具有极大的有益，因为荧光蛋白和生物体都患有这些问题。使用适当的制备和微观设置，报道了高达几毫米的成像。激发的精确定位使其适用于光子操纵。该方法在神经生物学中发现了广泛的应用。
在纳米尺度上研究细胞动力学
刺激的排放耗尽（st显微镜使科学家能够研究超出光学分辨率限制的结构。这种技术利用荧光染料的性质，激发发光，以消除可检测的信号。在50-70 nm范围内的胞内结构已成功成像。提高分辨率对于研究细胞内的小结构非常重要。特别是对于那些想要研究共本地化事件的人来说，分辨率的提高可以产生更现实的结果。的随机独立性st与其他超分辨率技术相比，能够实现非常快速的成像。视频速度st- 必须达到公正，这允许实时研究蜂窝动态。
图3:stVero细胞，结构:EB3，瞬时转染;标签:俄勒冈绿色488。
生物细胞的异点 - 空间测量
荧光寿命成像具有以下优点，即数据不依赖于信号的强度。因此，它不受像光漂白和浓度变化的常见伪影的影响。使用时间相关的单光子计数，这部电影利用单分子检测数据重建图像。可以记录和分析以亚纳秒为单位的荧光寿命的最小变化。该方法是万能的调查任何类型的细胞外和细胞内的环境修改，导致荧光寿命的变化。这部电影——基于烦恼分析对发射强度不敏感，因此提高了定量数据的精度。
CARS和SRS -无标签方法使用振动对比
几乎所有的活细胞荧光成像方法都是基于荧光蛋白的遗传表达。这涉及大量的技术努力和可观的费用。此外，外部基因的表达可能会改变微环境，从而导致生理现实数据的变化。相干反斯托克斯喇曼散射(汽车）显微镜和刺激的拉曼散射（SRS）显微镜是非线性共焦方法，其不依赖于荧光染料。这些无标签方法将样品中特定化学键的振动状态图像图像。在轴突周围的生物体中的特定化学键的积累可以在高分辨率和优异的信号 - 噪声质量周围成像，例如高分辨率，而不需要染色。
未来是量化的
生物学研究已经离开了描述性调查的年龄，并进入了定量分析的时代。新的Live Cell成像技术在空间和时间内的较高分辨率方向上发展。技术发展现在集中在纳米范围内单个分子的定量研究，以及少数皮秒短的分子反应。
