Multiphoton显微镜 - 满意的愿望清单

生物样本通常代表具有不同折射率和吸光度的微小结构的非常复杂的汞齐。即使显微镜的定义和敏感性在最大值，焦平面也被这些（光学）损害结构包围。如果没有适当的措施，我们会很难在普通的生物样本中看到任何东西。制造样品的薄片，通常通过使用微量立孔完成的样本提供足够清晰的图像，但与活物质不兼容。

光学方法有共聚焦显微镜和光片显微镜。在光片显微镜中，样品被一层与观察物正交的薄层照亮，类似光学切片切割。共聚焦显微镜是一种基于衍射有限光斑点扫描样品，并利用衍射有限光斑检测信号的共聚焦显微镜。这两种信息的叠加会导致焦外信息的空间过滤。

另一个光学选择是非线性照明，最初描述为双光子激发［1］由M.Göppert-Mayer。由于对光强度的方形依赖性，激发被约束到光子密度足够高以引起显着信号的层：通过焦平面中的选择性激发产生切片。对于荧光，我们需要做的就是用波长照亮，大致加倍单光子激发所需的波长。作为一种非常有益的副作用，散射与波长的第四功率成反比，允许与较长波长成像的主题内部的细节［2］．

生物显微镜的一个核心要求是不同信号的相关性，例如不同染色结构或代谢信号。在许多情况下，使用两到三个荧光染色，在某些情况下甚至更多。通常，需要不同的激发波长才能令人满意地激发所应用的荧光染料。虽然用于多光子激发的激光器是可调谐的，但同时记录需要多个激光线同时注入光束路径。因此，最好有三个或甚至四个独立的端口用于将激光器耦合到仪器中。的TCS.SP8 DIVE由徕卡微188金宝搏的网址系统提供耦合高达四红外(红外)线。

显微镜的照明——首先——总是设计利用物镜的全分辨率。这就转化为后焦平面的均匀照明。由于激光的光束是高斯分布的，因此必须对光束进行扩展以保证所需的照明模式。瞳孔边缘的强度下降——就像高斯曲线一样——对应的是瞳孔直径变小，因此清晰度降低。由于不同透镜的瞳孔直径可能不同，这将是有用的有一个可变的光束扩展器，以适应这些不同的直径。

另一方面，当扩大激光束以“溢满”透镜的瞳孔直径时，我们会牺牲一小部分能量。对于靠近表面的位置，这种过度填充不是问题，因为散射还没有去除大量光子，我们仍然有双光子激发所需的高密度。如果我们将焦点越来越深入样品，散射将导致光子的损失增加，激发效率将相应下降。在表面下的某个位置，光子密度将太低，不足以产生足够的荧光来记录一幅像样的图像。在这里，通过缩小光束直径来增加通过瞳孔并到达焦点位置的光子数量，我们会牺牲一点分辨率［3］．利用徕卡微系统公司的可变光束扩展器(VBE)，我们可以更深入地观察微观物体。188金宝搏的网址用户可以调整光束以获得最深的洞察力和最精细的细节(图1)。

由于多光子显微镜的光学部分本质上是由非线性激励产生的，因此光束路径不需要针孔。因此，从扫描光照点发射不一定要通过扫描模块(扫描镜)形成静态光束，但可以直接从样本收集。由于荧光发射只能从已知位置的光点发出，因此信号始终以精确的x、y和z值存储在计算机的存储器中。通常使用“非扫描”探测器，即可以直接安装在样品下方(透射光非扫描探测器)或上方(反射光非扫描探测器)的传感器设备。与扫描路径相比，这些非扫描探测器允许明显更多的发射光被收集。

一如既往，该设备也必须执行多参数荧光。因此，在这种情况下，需要将若干传感器组合起来，并将必要的元素关联起来，以便将所需的发射光谱的分数导向传感器。传统上，这些元件是用于分离光谱带的分束镜(次级分束器)。为了进一步细化光谱范围，以避免串扰，玻璃屏障过滤器安装在每个传感器的前面。在经典的情况下，滤波器和分波器具有固定的光谱特性，需要手动改变。

对于真正的专业操作，我们希望拥有一个设备，即使在图像采集期间也能够允许每个光谱频带的不受限制地调整每个光谱带。此调整也应伺服控制，无需手动重新安装任何部件。它应该以与着名的方式相同的方式运作SP.徕卡微系统公司的探测器。188金宝搏的网址只要使用图形界面定义一个光谱波段，仪器就会确保您以最高效率和最小串扰得到所需的信号，当然，对于所有四个通道。光谱非扫描探测器，4Tune，由徕卡微系统188金宝搏的网址[5]对最多四个非脱氯化检测通道执行自由频带选择（图3）。它包括一种巧妙的方法来避免扫描过程的频谱变化[6]．4Tune可以轻松适应任何可见和近的荧光发射红外波长。它替换了手动转换过滤器和二向色镜，具有固定规格。