为什么是多参数显微镜？
在生物医学研究领域中，荧光显微镜通常关注一系列不同颜色的发光的相关性。188bet怎么注册不同的颜色代表了特定的染色结构或代谢参数。生物学是研究生物体的科学。生物甚至在微观尺度上也在运动。这一事实不仅适用于快速移动的原生动物，也适用于像植物这样被认为是静止的个体。细胞室、蛋白质和代谢分子通常用不同颜色的荧光标记物进行标记。多光子显微镜增加了其他选项，比如第二和第三次谐波生成。这些颜色通道最好同时记录，即并行记录，以保持它们在高度动态变化的邻域相关。通过这种方式，同时记录保存了所研究的生物参数之间的时间和空间相互关系，也提高了时间分辨率。它需要多个不同颜色通道的光传感器，这些传感器并行工作，并同时提供光谱的相关部分。
另一种方法是顺序记录，即为不同的光谱分量逐个提供一个传感器，并记录每个分量的图像，然后叠加。使用顺序方法，不仅会丢失空间和时间相关性，而且时间分辨率至少降低了一个等于记录参数数量的因子。因此，总的数据采集需要更多的时间:以相同的因素。
用于同时记录的分离光谱发射部分的经典解决方案是二向色分束镜和势垒滤波器的布置。这种设计的缺点是，对于改变染料组合，系统必须提供适当的过滤器配置，使其成为成本高、速度慢且不灵活的解决方案。
可调谐多带检测
对于单通道系统，使用分光计来消除这种不稳定性。徕卡激光技术公司推出了第一个多通道光谱测量设备，该设备具有可自由调谐的共聚焦显微镜探测通道，允许同时记录不同颜色的图像［1］1997年：美国SP-探测器。
这个SP-共焦显微镜的探测器解决方案采用一个棱镜，将探测光分为其光谱分量，并采用一组级联的分光计狭缝，将可调谐波段传递到传感器上。电动屏障由反射镜构成，因此，允许互补部分进一步定向到传感器上。通过这种方式，可以将整个频谱切割成若干部分，并且可以对每个部分进行微调，以实现信道的最佳分离，而无需计算数字运算。这个概念依赖于一个事实，即共焦显微镜中的发射光束是静止的。扫描运动由发射光以相反方向通过的扫描镜补偿。然后，静止光束通过检测针孔馈送，产生光学部分。
然而，在多光子显微镜中，光学部分是由光子的非线性相互作用产生的，只有在焦平面上才有足够的密度。因此，不需要针孔，发出的光在通过扫描设备之前就可以被检测到，即非扫描检测。这种方法对于像许多生物样本这样的浑浊物体内部的成像尤为重要，因为它们显示出显著的散射导致光子损耗。使用非扫描检测器，采集效率更高，图像更清晰，研究人员可以更深入地观察标本内部。然而，这个概念没有固定的光束，这导致光谱在棱镜和光谱仪狭缝上摆动，导致位置依赖的光谱响应。
梯度的选择
到目前为止，在非扫描探测器中各种发射通道的分离是通过固定光谱规格的二色镜和势垒滤波器完成的。当实验装置改变时，也需要更换过滤器。没有办法通过不断改变滤波器参数来优化性能。一个明显的解决方案是将光谱固定元素与梯度元素交换。与普通的二色分裂器和滤波器不同，梯度元素的特征是沿着一个空间维度的光谱变化。简单的颜色梯度过滤器通常用于效果摄影，但也有高性能的介质过滤器和分裂器。当梯度滤光片在光束周围移动时，出射光束的光谱特性可被连续调谐。因此，梯度过滤器被草率地称为“可变过滤器”。图1显示了二向色光束分裂的原理，它类似于短通或长通滤波。
图1：用作可调（可变）二向色分光器的梯度二向色器的性能。左：发射（E）通过可变二向色性分离器VDS分为两个色带。从反射（R）到透射（T）的转换发生在长波长（λ）处。右图：在移动VDS的位置时，开关R到T的波长较短。
我们需要同时记录多个通道的全部工作就是使用光谱的透射和反射部分来进行梯度二向色性的级联，以便进一步分割。为了微调收集的发射，我们可以在探测器前面放置可变短通和长通滤波器的组合。
到目前为止，一切顺利。但新的挑战
虽然我们可以建立一个非扫描检测器与可调谐的光谱检测通道梯度过滤器，扫描显微镜需要一个巧妙的设计设置。这种设计是由于扫描光束的角度和位置变化以及梯度介质滤光片的特性所引起的。下面两部分将对此进行讨论。
扫描显微镜
扫描显微镜是用来移动光斑焦平面的两个方向,x和y。因此,梁的位置是不断变化的焦平面(F在图3)或任何平面共轭的领域,例如,中间图像平面。
在与物镜后焦平面重合的瞳面(见图3中的P)，位置是固定的，但角度会随着扫描过程不断变化。利用这种关系可以方便地扫描样品，而无需移动样品或光源。扫描镜被放置在一个与后焦平面共轭的平面上。扫描时，反射镜改变光束角度，从而转换为焦平面上的位置变化。
在任何平面上，如位于F和P之间的G，角度和位置都随着扫描而改变。
过滤器特性
不同设计的过滤器根据其位置和角度表现不同(见图4)。
颜料滤光片:对于传统的彩色滤光片，通常是一片含有颜料的玻璃，光束通过滤光片的位置对光谱性能没有影响。当这样一个滤光片不垂直照射时，光通过均匀材料的距离就变长了。因此，传输减少。
干涉滤光片是由在空玻璃基板上按特定顺序涂覆多层介质材料组成的，因此也称为介质滤光片。这些层使通过的光线相互干扰。层厚和材料组成的结合使滤波作用得以实现，使频谱的所需部分通过滤波器，而互补部分被反射。一个不在垂直照明下工作的干涉滤光片可以同时收集透射和反射的分数。在这种情况下，滤光片被称为二向色镜。对于涂膜均匀的滤光片和二色镜，照明位置对透射光没有影响。然而，入射角度的变化会导致二色镜的颜色发生显著变化。通常它们的入射角在45°左右。对于在垂直入射时工作的干涉滤波器，其变化可以忽略不计。
梯度干涉滤光片与均匀干涉滤光片具有相同的特性，但颜色响应沿一个空间方向变化。因此，入射角和角度都取决于传动方向。这种解决方案对于扫描显微镜来说似乎是最糟糕的，因为光谱特性在扫描过程中会在光束中的任何位置发生变化。
因此产生了一个问题：有没有一种方法可以在非去扫描光束路径中使用梯度滤波器进行多通道检测，尽管存在所有这些颜色效果？
问题+问题=解决办法
如果我们把梯度滤波器放在一个共轭的平面上领域，那么我们就会因颜色的变化而变化位置. 在与平面共轭的平面上学生我们会因颜色的变化而变化角.
但是如果我们把过滤器放在一个好的位置（图3中的位置G），如果我们设计了合适的过滤器涂层，那么我们可以使这两种效果相互抵消[2]. 光路和滤波器的设计计算有些繁琐，但可以得出一个实用的解决方案。这些结果是通过徕卡微系统公司的4Tune探测器实现的。188金宝搏的网址
徕卡微系统公司的4Tune探测器采用上述技术。S188金宝搏的网址P8 DIVE集成了梯度二向色性和滤光片，提供四个自由和独立可调的光谱通道，用于多光子显微镜中的非脱扫描检测。用户可以在直观且排列整齐的图形软件界面中轻松定义所需的波段。该界面允许用户设置荧光光谱带，以实现最佳效率和通道分离。它还允许无缝调谐检测二次或三次谐波，只要改变照明波长-与荧光记录同步。
