2017年7月6日故事

多色多光子显微镜激光光束整形

可调光束直径和匹配焦点位置长达四波长红外(IR)

多光子显微镜是目前生命科学研究的热点话题之一。新从徕卡Microsystem188金宝搏的网址s SP8潜水提出了一系列有益的创新,包括自由可调non-descanning检测器和一个巧妙的梁VBE操纵装置。变量光束扩展器提供免费调优光束直径和轴向红外修正四个红外同时梁。

的彩色照片是一个多通道记录„Confetti-Mouse”,用徕卡4优化光谱探测器的体内深处Explorer SP8潜水。非凡的可能性适应的发射光谱带转基因检测到标记提供了更高的对比度并行多通道记录在深居住样本。(样本和数据由j . van Rheenen h . Snippert乌特勒支(荷兰语)和斯坦梅茨,徕卡Microsystems曼海姆)。188金宝搏的网址

作者

¹188金宝搏的网址

主题和标签

多光子显微镜

非线性照明

1931年,在她的博士论文,玛丽亚Goppert-Mayer假定电子系统的兴奋性的同时吸收两个光子跃迁所需能量的一半从基态到激发态[1]。如果激发染料是可能的,例如450海里,应该有可能激发相同的染料在900纳米左右。这里的关键字是“同时”,这意味着第二个光子必须到达的站点当第一个光子仍在那个地方。这种现象是可以实现的只有在空间和时间的“浓度”光子是非常高的,也就是说,在非常高的光强度。

密度高的红外线可以生成在物镜的焦量与高强度照明时红外(红外)激光。获得二维图像,重点必须扫描在微观领域。一个非线性扫描显微镜照明最初被科林·谢泼德[2]。全面审查的话题扫描共焦和多光子显微镜已由A . Diaspro提供[3]。

为什么一个花钱精细扫描显微镜和贵吗红外激光,如果荧光图像可以通过简单的荧光显微镜吗?多光子激发提供了两个重要的好处:

固有光学切片:
激励取决于双光子激发荧光强度的平方。足够的强度只存在于震源体积。因此,只有通过荧光分子兴奋和释放。
照明深陷层:
瑞利散射,生物样本是浑浊的,原因是成反比的四次方的波长。当照明波长翻了一倍,通过瑞利散射缩小百亿资金的损失。(随后发射的荧光和/或高阶谐波仍将经历强烈的散射)。

方法采用点扫描显微镜,多光子激发系统通常建立在一个平台共焦光束扫描显微镜。必要的修改的安装高强度脉冲红外激光。

光束直径

显微镜的主要目的是提供高的光学分辨率放大图像。需要放大结果图像适应我们的身体查看设备的分辨率,人类的眼睛。所需的高分辨率光学揭示研究对象的新细节。光学分辨率基本上是由光的波长(颜色)和使用的物镜的数值孔径。时达到的理论限制光学设备可以单独的两个物体的距离d的定义为:d_一个=λ/ 2 na。

这个公式类似恩斯特阿贝的注意事项[4][5][6]表示,由下标a .根据方法和先决条件,理论限制是不同的,但总是不太远离Abbe-formula。(简要对比请参考另一份报告的作者[7])。

这个极限需要照明均匀分布在物镜的后焦面。甚至要求意味着强度:相同的亮度,瞳孔平面上的每一点的(图1)。

在激光强度(截面梁宽度)甚至没有。它,而像一个2维高斯函数分布(最好的情况)(图1)。以确保均匀照明,激光通常是扩大和只使用内部的分数。剩余强度的降低外围然后可以忽略不计(图1,左行)。

图1:不同激光光束直径)强度分布的影响我的梁,以高斯径向分布。通过光改变光束直径,形状是一样的,但是最大的强度可能会增加(光束直径小,右)或减少(宽直径、左)。的总能量是没有改变。b)左:获得完整的决议,强度分布在焦平面P(学生)应该是平的。这种一致性是通过“堆砌”学生宽光束直径。物镜,L,将光聚焦到样品,在焦平面。右:生产足够的双光子激发荧光,一个可以使用一个小的光束直径为了不切掉激发能量。强度分布的学生就不平坦,而边缘部分较暗,实际上对应于一个较小的NA。c)的体积是由波长(颜色)和数值孔径。完全分辨率,更广泛的光束会产生较小的体积(左),对应于高分辨率的x, y, z方向。 The energy may be less and produces correspondingly less fluorescence emission (green color). A narrower beam can excite more intense fluorescence (right) but correlates with a larger focal volume and, thus, reduced resolution. A distinct beam diameter can be calculated for optimal energy and resolution.

然而,这种操纵的梁原因技术困境:最高分辨率,强度必须均匀,但最佳多光子激发内心深处样品我们需要可能的最高的强度,不能切掉激光光束的横截面的重要部分[8]。实用的解决方案是一个变量扩束(VBE)允许用户决定哪些参数给定的实验任务是最重要的和适应的光束直径相应的(图1)。最优光束直径取决于瞳孔的大小,并相应地调整应。

徕卡的VBE微系统是一个可188金宝搏的网址调光学光束扩展器,允许用户修改照明光束直径在广泛实现分辨率和穿透深度的要求。该模块能够控股四个人变量扩束光学可以控制多达四个不同的性能红外波长分别同时。

焦点的位置

由于wavelength-dependence折射,光线不同的颜色显示不同焦点位置通过聚光透镜。这种效应被称为轴向色像差。可见范围的电磁波谱,从400年到700纳米,光学透镜显微镜和相机是为了减少这种类型的组合畸变的镜头显示不同的折射特性。更好的改正,努力和价格越高。对于特殊应用,眼镜纠正在不久的紫外线,以及镜头覆盖近红外范围,是可用的。

常见的镜头不纠正使用几种红外波长在同一时间。在这里,我们可以利用激光的单色和正确的光学激发的焦点的变量。通过引入散度偏差,可能会把重点转移不断适应任何红外颜色。这个结果是通过利用光束扩展器的设计变量,提供两个自由度,可以调整控制光束直径和独立的焦点位置。