培养的大鼠海马神经元

材料和方法
上培养的大鼠海马神经元,50μm厚论(论嵌入电影,EMS) 19天,被冻结在卵磷脂100μm深的一面涂(详细协议附录I)输入一个3毫米铜/非盟运营商(莱卡)和夹与卵磷脂平的一面涂B型3毫米铜/非盟运营商(莱卡)。没有使用额外的填充,只有细胞培养基的消息灵通的缓冲pH值7.2的最终浓度25毫米,样本冻在高压冷冻(徕卡EM冰)。在液氮冻结三明治被打开后,输入一个运营商都被转移到流通型胶囊(塑料胶囊D5 x H15 mm,徕卡)的自动化freeze-substitution设备(徕卡EM AFS2)设定在-90°c流通型胶囊与样本放入Sarstedt管800μl缪勒freeze-substitution介质(穆勒et al ., 1980),含有3% (v / v)戊二醛+ 1% (w / v)四氧化锇和0.3% (w / v)醋酸双氧铀在无水甲醇(详细协议附录II)。

样本保存在-90°C的48 h在这个解决方案中,从-90°C下逐渐加热到-60°C(增量2°C / h);保持在-60°C 8 h后加热到-30°C(增量2°C / h)。在-30°C样本保存8 h最后热身从-30°C + 2°C(增加10°C / h)和保持在这个温度为2 h。最后一个替换步骤后样本洗2 x 5分钟与500年μl无水甲醇,500 x 5分钟μl 50%无水甲醇+ 50%无水丙酮最后3 x 5分钟与500年μl无水丙酮。清洗步骤都是在徕卡新兴市场AFS2 + 2°c .洗涤步骤是由转移的流通型胶囊样品1.5毫升埃普多夫管包含500μl预冷清洗解决方案。体积800μl freeze-substitution介质选择有足够的能力来取代水丙酮的样本。500年所有下一步卷μl是用来防止损失的样本的流通型胶囊溢出。最后洗后无水丙酮样本与环氧树脂树脂渗透(详细协议附录III)。

渗透与环氧树脂树脂/丙酮混合物perfor¬地中海在4°C以下步骤:
Epon:丙酮= 1:2 2 h (33% (v / v)环氧树脂)
Epon:丙酮= 1:1 18 h (50% (v / v)环氧树脂)
Epon:丙酮= 2:1 8 h (66% (v / v)环氧树脂)
Epon:丙酮= 3:1 18 h (75% (v / v)环氧树脂)

渗透时间表100%环氧树脂在室温下进行:
纯环氧树脂8 h Epon (100%)
纯环氧树脂18 h Epon (100%)
纯环氧树脂6 h Epon (100%)

最后,流通型胶囊包含运营商和论光盘500年与神经元被μl埃普多夫管包含250μl纯环氧树脂,填满纯环氧树脂和聚合后在65°c . 72 h聚合材料胶囊被埃普多夫的管子用锋利的刀片,打开取出样品。周围的树脂载体被修剪掉之后,承运人可以从树脂中删除。下一论盘周围的树脂是修剪掉之后,论盘可以起飞与钳留下神经元树脂。大约70纳米厚恩的脸部分被削减的超微切片机(Ultracut开普敦大学,徕卡),并收集碳coated-Formvar-50网六角铜网格。对比6分钟的部分为7% (w / v)醋酸双氧铀在70%甲醇和2分钟雷诺兹柠檬酸铅。

显微图上获得Tecnai 12电子显微镜(范)在100千伏和spotsize 3。电子显微图(Binning1 2048高模像素)收集与TIETZ相机(TIETZ TVIPS TemCam F214)在15000 x放大(像素大小0.375海里)。