2013年6月12日教程

高压冷冻技术简介

水是最丰富的细胞成分，因此对维持细胞的超微结构很重要。目前，在不引起明显结构改变的情况下固定细胞成分的唯一方法是冷冻固定。目前常用的方法有两种;俯冲冻结和高压冻结。

冷冻固定比化学固定有两个明显的优势。它是在毫秒内实现的，并确保同时固定所有大分子成分。许多蛋白质网络是非常不稳定的，只要有最轻微的渗透或温度变化，它们就会解体，在低温固定过程中，这些有害的影响被降到最低。这些技术使生物样品的研究与改良的超微结构保存，并可以促进动态过程的研究。目前，玻璃化较厚的样品(200µm以下)的唯一方法是高压冷冻。

图片:秀丽隐杆线虫的结构细节，头部横断面(由Müller-Reichert T [MPI-CBG，德累斯顿，德国]和McDonald K[加州大学伯克利分校，美国]提供)。

作者

Cveta Tomova博士

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主题和标签

蓝宝石盘上生长的小鼠胚胎成纤维细胞(由英国布里斯托尔大学Verkade P提供)。

介绍

成功的冷冻固定(玻璃化)是在不引起冰晶成核的情况下将水从液体转变为无定形状态。冰晶的成核取决于温度和压力(见下图)。结晶也取决于冷却速率，因为冻结是一个依赖时间的过程。冷却速率取决于水的热特性、试样厚度和试样表面的热提取流。

在压力下冷冻生物样本的想法是由摩尔和瑞艾尔首先提出的［1］．高压冻结装置于1985年投入商业使用。目前所有的高压冷冻机，尽管有不同的设计，提供同步加压和冷却的样品在20毫秒内高度复制的方式。

Kanno等人的图表。［2］显示水的状态取决于压力和温度。在2045 bar压力下，水的熔点降至251 K，均匀成核的温度降至181 K。

高压冻结的新维度

根据Leunissen和Yi介绍的自加压快速冷冻原理［3］一项新技术已被开发188金宝搏的网址．它利用密封样本载体内的水在冷却时膨胀的趋势，从而内在地产生压力，而不是使用外部液压系统。这种压力可能是在密封的试样载体内形成结晶和低密度冰的结果。达到压力(2010 bar)，使冰的熔点降低到251 K (Kanno等人。［2］)标本载体内60%的水需要转化为低密度冰。

透过物理的镜子

相对于液态水，低密度冰的形成会导致体积膨胀。数值模拟表明，沿管壁的冻结继续在中心冻结，产生一个强烈弯曲的冰锋。当浸水速度最大时，这种影响最为明显。当冰锋尽可能平坦时，低密度冰区域与冰冻良好或玻璃化部分之间的分离被认为是最好的。这可以通过改变每个具体情况的冻结参数来实现徕卡EM防晒系数程序界面。在浸冰运动过程中，管内的成冰前沿始终高于低温原表面水平。冰锋的距离取决于浸入速度。

应用- CLEM(相关光电子显微镜)

图1:蓝宝石圆盘上生长的PtK2细胞的总体图像:位于靠近细胞上方用于追溯样品的探测器网格。

图2:迪拜国际资本和荧光图像:当一个感兴趣的细胞被定位迪拜国际资本并制作荧光图像(内化EGF-QD655)。叠加图(右图)显示了细胞中含有EGF-QD655结构的位置。方框区域是单元格内感兴趣的区域。

图3:感兴趣细胞内的荧光量子点:跟踪感兴趣细胞内含有荧光量子点的结构，每秒钟拍摄一张图像，形成一个电影序列。静止图像，显示图像间隔5秒，从这个电影序列显示。最后一幅图像是序列的最后一幅图像(因此时间= 0 s)。此时快速装载器从舞台插入到RTS中，样品被冻结。

图4:感兴趣细胞的电子显微镜图(左)，放大到感兴趣结构(右):感兴趣细胞的电子显微镜图(左)。方框区域是包含感兴趣结构的区域，右侧显示了对感兴趣结构的放大。箭头表示可以在结构内部识别的量子点。将该结构的c形与图3的最后一张图像进行比较，可以观察到一个可比的c形。请注意，电子显微图来自70 nm的切片，而荧光图像约为1 μm厚。

由英国布里斯托尔大学Verkade P提供。

相关仪器:徕卡EM PACT2与徕卡EM RTS

应用程序——CEMOVIS

这些部分是用冷冻的酵母徕卡HPM100在铜管系统中，将细胞糊与pH 6.5的MES/右旋糖酐缓冲液混合，最终MES浓度为50 mM，右旋糖酐浓度为20%。

这些样品是在一个徕卡EM UC7/EM FC7在-140°C下使用Micromanipulator，切片厚度设置为50 nm。切片贴于琼脂花边网架上。

使用装有4k Gatan的Tecnai Polara 300KeV (FEI, The Netherlands)显微镜对切片进行成像CCD相机。切片的放大倍数为23 K，断层图的离焦为-6 um，投影图像的离焦为-8 um，衍射用相机长度为930 mm完成。面板左侧的图像是用IMOD包重建的中央10片图像的平均值(Kremer等人[4)的图像处理软件。