共焦激

在共聚焦显微镜中激发荧光的光源是激光器或不同颜色的激光器的组合。激光是出于技术原因而使用的[2]不幸的是，传统的激光器通常只发射一个波长，或者只有几行（现代的解决方案是白光激光器）[3.]). 然而，在生物医学成像中使用的荧光染料在光谱中的任何地方都能显示出激发带188bet怎么注册紫外线和附近的红外. 在大多数情况下，有必要同时记录几种不同荧光染料的发射。为了完成这项任务，一系列激光束通过二向色镜组合。在这种情况下，与在荧光照明中分离激发光和发射光的“分束器”相比，反射镜以反向模式使用。

由于激光器一般具有较窄的工作频带和低噪声，因此不宜直接通过激光功率来控制激光强度。因此，需要一种允许激光强度单独衰减的装置。同样地，如果光源多次开关，激光寿命也会降低。特别是气体激光器在高温下不允许开机。

所有这些要求的一个典型实现是一个“激光电池”，由一系列激光器(通常是3到5个)组成。所有激光器都配备了由电动机械驱动和软件控制的光闸。所有的激光器都需要一个伺服控制装置——一个带有一系列灰色滤波器的轮子或滑块——来实现衰减。多线激光器还需要一个轮子或滑块，其中包含一系列边缘和带滤波器，以便选择一条线或线的组合。

显然，整个设置可能会变得有点复杂，它容易失调和漂移问题，它可能引入机械振动在过滤器选择。当需要修改照明系统时，它也非常慢，而且由于轮子或滑块上的过滤器数量有限，该设备也非常不灵活。

为了简化机械设置和增加数量级的灵活性，一个重要的步骤是实现声光滤波器(AOTF)。基本上，AOTF是一种设备，它允许控制所需的颜色指向不同的方向，而其他颜色直接通过AOTF [1].AOTF由晶体制成，通常为TeO₂或SiO₂或其他具有类似性质的化合物。晶体由机械换能器在几百兆赫的范围内激发机械波(术语“声学”指的是机械波，尽管频率不符合我们所标记的声学可听性)。最重要的是，光束偏转的方向是固定的，不依赖于光线的颜色。另外一个好处是，应该指向所要求方向的光量可以由机械波的振幅控制。

当使用“激光电池”提供的各种波长的（准直）激光线进行辐照时，AOTF允许拾取任何线，并将其定向到所需方向上所需的全部强度的任何部分。可以同时选择多条线路。这个数字主要取决于人们准备投资的电子设备数量。体面的系统同时提供8条线路。

总而言之，AOTF完全取代了所有的百叶窗，衰减滤波器和线选择滤波器上面描述的单晶，机械固定在地方。行的任何组合都很容易选择;当激光电池提供总共8行，组合的数量达到256 -不是一个问题的AOTF。附加:每一个选择线是无级可控的强度。本质上，AOTF是一个“8通道激光调光器”。

工程师们可能会争辩说，AOTF使两种偏振模式向不同的方向定向。这是完全正确的，但并没有损害这个概念。无论如何，激光都是偏振的，因此光总是指向想要的方向。垂直方向将保持空无一物。

除了显而易见的好处AOBS允许任何适合特定样品中荧光色素成分的激光组合，具有进一步的优点。让我们假设样本用两种不同的荧光染料染色，一种非常强，另一种非常弱。在这里，无级强度调谐允许平衡荧光发射，以便通过调暗明亮染料的激发来记录强度相似的两种荧光。这很容易在成像过程中在线实现。AOTF的控制速度很快，不需要停止扫描过程。

采用无级强度控制来平衡激发不仅有利于荧光通道的可比性，而且是改进荧光色素分离的有价值的工具。许多染料在它们的发射光谱中显示出长长的“尾巴”，导致错误的染料在正确的通道中被捕获。通过将激励降低到最小值，可以改善分离(减少串扰)。

最后，所选线条（和强度）之间的切换速度非常快，仅需几微秒；相比之下，机械标准过滤轮的过滤时间约为1秒。此快速开关允许在扫描一条线的过程中改变照明状态（哪条线的强度是多少）。此功能用于在样本上绘制不同照明颜色的图案，即所谓的“感兴趣区域”，其中不同的激光器处于活动状态。它还用于“变黑”无需记录信号的区域。这使样本的这些区域保持活力，以备日后研究。本文开头的图片显示了这些感兴趣的区域，在一次扫描中应用了5种不同的参数设置。

最后，如果选择白光激光器作为光源，AOTF可以选择白色光谱中可用的任何颜色。在这种情况下，可调谐声光滤波器将白光激光源转换为可调谐光源。