白光激光器

传统的激光源通常只提供一次狭窄的发射。有些气体激光器可以同时发射出几根线。最著名的例子是氩气激光器，它可以在蓝绿色范围内提供5条线。其他激光器，如染料激光器，是可调的，但一次只能发射一种颜色。此外，染料激光器非常不稳定，需要一些耐心才能正常运行。固态激光器是可调的，但仅限于红外范围(例如Ti:Sa激光器)。除了它们的高度复杂性和昂贵之外，它们一次也只能发射一个波长，而且调谐过程非常慢(许多秒)。

随着光源的发明，这种情况完全改变了，光源可以同时在大范围内发射，但在可聚焦性方面仍然像激光器一样[1］．

这些来源使用一种纤维红外激光器发出约80兆赫兹的光脉冲。这种化合物被用作“种子”，即提供一个精确的时钟，但能量相当低。这些脉冲随后在二极管泵浦的激光放大器中被放大。放大激光器也是基于光纤的，两个系统通过光纤拼接实现无缝耦合。放大器的输出可达约10 W的红外光平均功率，但在80兆赫兹时以约200ps的脉冲进行斩波。这些高能脉冲最终聚焦在所谓的光子晶体光纤(PCF)的进入表面。这些纤维的特点是在纤维的中心有一个空心管的图案。管状图案表面的强非线性过程导致单色光扩散成广谱，达到蓝色甚至紫外线，包括群速度色散(高达4^th序)、自陡度、喇曼散射和等离子体裂变。

根据PCF的长度，单色性不同红外峰值可扩展到几百纳米的光谱。典型的光纤长度为0.5 ~ 2米。

与其他使用白色光源进行荧光照明的显微镜一样，白光激光共聚焦显微镜[2需要一种选择颜色的方法来特别激发各种荧光色素。如果可能，多种颜色对多重染色样品的平行激发是有用的。在宽视场荧光显微镜中，这个任务是由激发滤波器来完成的。多染色样品使用带有三或四个透射带的二色滤光片。

从超连续体发出的光束提供了一个更通用的解决方案。声光可调谐滤波器可以从频谱中选择一条线(实际上是一条窄带)，并将其偏转到不同的方向。其余的光谱将直接穿过晶体。由于带带的颜色是由控制偏转的机械激励频率无级可调的，输入光谱中的任何颜色都是可选的。该带的宽度约为1,3nm，取决于波长。这种带的能量是在几毫瓦的范围内，这是远远足够的成像，甚至经常使用收紧实验。通过增加更多的电子驱动器在晶体中产生机械波，就有可能同时将一系列颜色导入1^圣秩序。八种颜色同时出现是标准(但不是技术限制)。每个带宽在波长和强度上都是可调的。

这种组合使得白光激光(will)成为共聚焦显微镜的理想激发源。它适用于可见范围内所有已知的可激发染料，它允许记录激发光谱，以探索新染料的光谱特性，特别是在原位。它还提供了调整激发非峰的自由，如果这是必要的发射收集原因或改善相邻染料的分离。

光谱探测器(SP)设计用于完全控制探测发射波段的带宽和中心颜色。这保证了最高的吞吐量(传输效率)和最佳的分离。作为一个副作用SP探测器也允许记录发射光谱——可以同时(5个通道)或顺序(多达400个通道)，或两种方法的混合模式。在过去，发射颜色被绑定到由安装在系统中的激光发射的几行。使用白光激光器(WLL)，情况完全改变了:由于颜色可调，精度为1nm，平滑的激发光谱可用于整个可见光谱。结合SP探测器，可以适应伺服控制的激励波长，这是完全自动执行的测量。采用声光分束器对激发光和发射光进行引导，是一种合理可行的方法。

有了可调谐的激发和可调谐的发射，下一步是创建强度的二维相关图[4］．当需要分离复杂的荧光色素混合物时，这个λ平方图特别有用。当需要对荧光色素进行表征时，它也具有一般价值——无论是因为它们是新发现的或设计的，还是因为对微环境条件引起的光谱变化感兴趣。

荧光的特征是发射强度和荧光寿命。为了精确地测量寿命，需要一个脉冲光源。幸运的是，白光激光器是一个脉冲源，脉冲频率符合典型荧光寿命(在0.5…5纳秒范围内)的需要。如果需要较长的脉冲间隔，则脉冲拾取器降低脉冲频率。当然，白光激光器的可调谐性直接使寿命激发光谱成为可能，包括下一个逻辑结果:二维激发-发射寿命图。

最新的技术使最后一件事成为可能。混合探测器(HyDs)是非常灵敏，快速和覆盖大的动态范围。它们还提供了一种门控操作模式。与脉冲白光激光器结合，现在可以仅在光脉冲之间的时间检测荧光发射——只需要对混合探测器进行门控，在激光脉冲期间不收集信号。检测到的信号是纯荧光发射，不包含任何反射光。用这种方法，对抗残留反射的颜色之战就很容易获胜。不需要给激发色留下足够的空间来限制发射集。甚至可以直接测量激发态的下方和上方，这样就可以对反斯托克斯发射进行表征。

采用脉冲和光谱可调白光激光光源，结合声光可调分束器，实现了可调SP探测器和门控混合探测器是最新技术的迷人混合。而且，尽管这句话听起来有点老生常谈，但它适合这里:它彻底改变了共聚焦显微镜的概念和操作。