二次二向色镜
自1970年以来，生物显微镜领域对多参数荧光显微镜的需求越来越大。在最简单的情况下，用于单通道设置的滤光片和分色器将固有地允许在蓝色或蓝色背景上记录例如绿色和黄色/橙色荧光紫外线激发（当时一个被遗忘的标准是Feulgen染色法，它可以通过不同的发射颜色识别DNA和RNA）。宽视野显微镜通过使用彩色摄像机来响应这一要求。有时，特别是对于定量测量，图像被分割，两个通道在同一芯片上并行成像。最先进的是同时使用两个或多个并行摄像头。在真正的共焦扫描显微镜中，传感目标的分离是不可能的。因此，通过添加第二（第三…）光电倍增管立即实现了多参数荧光。数据以并行方式记录，或者直接显示在屏幕上，例如在监视器的3个彩色通道中，或者以电子方式存储以供以后分析。要显示3个以上的通道，信息必须分布在3个可用的监视器通道中，这不可避免地会导致分离度和强度分辨率的损失。然而，现代显微镜不仅仅是关于明亮的图像（我们用眼睛只能分辨出三个通道），而是针对定量测量。这里，只要通道的数量不超过样品中氟铬物种的数量，任何数量的通道都是有意义的。
将发出不同颜色的荧光色素的发射定向到传感器组的最明显方法是使用分色镜。二向色镜反射波长比二向色镜指定波长λ短的光0并传输波长更长的所有颜色。这对于“长程二向色镜”来说是正确的。“短程二向色镜”将发射较短的波长并反射光谱中较红的部分。在图2中，一组三个二级二向色性1.s2.和S3.用于将整个频谱分成4个不同的方向，传感器随后可以收集4个不同的通道。二次二色镜的选择必须根据所用荧光染料的光谱发射特性。因此，给定的一组可能适合若干发射相似的荧光色素，但如果荧光色素组合具有显著不同的发射特性，则不适合。为了解决这一问题，使用二次二色度进行分色的系统在每个分色位置都配备了轮子或滑块。这些传感器配备了一系列不同的二色镜，允许有限数量的不同色带通过传感器。显然，这种解决方案不是很灵活，需要大量的伺服技术和调整(至少在几个月的时间里，预计可以保持稳定。如果安装了许多激光线，潜在发射带的数量将会增加——因此需要次级二向色线的数量也会增加。使用白光激光源，发射滤波器的概念将无法合理地适应，只有一个连续可调的设备将适合。图1显示了从1995年起次级二向色概念的实施情况。
棱镜色散
1)棱镜，2)滑块，3)探测器
伊萨克·牛顿爵士在1704年的《光学显微镜：棱镜的使用》一书中描述了（有意）分离光的颜色的最古老方法。这篇文章的前言中附有他那本书中的一幅绘画作品。今天，我们的解释是，波长较短的光在光学不同介质的边界处的衍射强度比波长较长的光更大（得出一个简单的结论）。如果颜色的混合物——如一组荧光颜料的合成发射——通过棱镜馈送，合成发射将被光谱分解。
分解的强度取决于许多技术参数，但与样品或传感器无关。这是一个非常有效和简单的解决方案，可以解决一组荧光染料向不同方向的发射问题，随后可以记录这些发射。在最简单的情况下，只需ce是沿着光谱的一系列探测器。这一概念已经实现，但在收集效率和灵活性方面存在严重缺陷。一个更好的解决方案是多波段设备，它允许为每个传感器单独选择整个光谱的任何部分进行记录。
棱镜具有白(平)透射的优点，即棱镜(在规定的光谱范围内)没有吸收调制。透射和色散与偏振方向无关。这是一个重要的事实，因为荧光色素的发射总是无偏振的。最后但并非最不重要的是，色散只发生在一个方向上——在选定的顺序中没有其他的“顺序”可以降低强度。
对分散光谱的线性度进行了一些讨论。基于棱镜的光谱相对于波长不是线性的。对于技术设计而言，这不是问题，只要不一定要使用线性探测器阵列，如多阳极光电钳或类似设备。
光栅色散
棱镜的另一种色散元件是光栅。透射光栅和反射光栅都在使用。当使用入射光束照明时，光栅的周期性结构将导致光偏转到各个方向（通过干涉过程）。
直线方向（0th命令)不显示任何色散。1圣顺序通常是选择的方向。在这里，光被传播成光谱，非常类似于棱镜中的色散。然而，还有更多的顺序，例如2钕和更高的订单，但订单反映了1圣…nth光栅另一侧的顺序正常。光栅制作的艺术在于将尽可能多的能量集中在一个单一的顺序中。
对于平行于或垂直于线（槽）方向偏振的光，光栅的性能也非常不同。在最佳情况下（取决于各种参数），垂直波可以产生相当有效的光谱，而平行波在距离火焰波长两个八度范围内显著下降，约为零。由于荧光是非偏振的，所以总效率由垂直效率和平行效率之间的平均值来描述。在可见光范围内，在200 nm范围内下降到30%是常见的。
这使得光栅对于效率（光子收集性能）不高的仪器来说是非常低效和不合适的色散装置是一个关键问题——这在共焦荧光显微镜中非常常见。如果实施，通常会附加一系列额外的设计元素，试图将丢失的光子引导至传感器（有时称为“光子回收器”）。
更复杂的是，与棱镜相比，光栅表现出更多的杂散光损耗。
图6：光栅产生包含入射光束光谱的多个阶数。绝对效率通过使用的阶数与入射光束的比率来计算。
分散剂的比较
如上文所述，共焦显微镜中荧光发射色散的各种概念各有优缺点。下表显示了比较概述。显然，棱镜是完成该任务的最佳选择。
| 棱镜 | 栅栏 | 二向色性 | |
|---|---|---|---|
| 变速箱 | 0.95 | 0.75:0.9（火焰）–0.6（红色） | 0.9（规范部门） |
| 传输p | 0.95 | 0.6:0.8（火焰）–0.4（红色） | 0.9（规范部门） |
| 传播(λ) | 白色 | 火焰依靠 | 规格取决于 |
| 高阶损失 | 不 | 是的 | 不 |
| 全光谱探测 | 是的 | 是的 | 否（边缘不是无限陡峭） |
| 独立于设置 | 是的 | 是的 | 否（分散度取决于实际元素） |
| 机械稳定性 | 是的 | 是的 | 没有(轮子，滑块…) |
| 杂散光问题 | 低的 | 高的 | 低的 |
