立体显微镜在发育生物学和医学研究中的高效工作:啮齿动物和小动物外科188bet怎么注册

外科技术用于发育和医学研究中涉及小动物模型有机体(主要是小鼠)的各种研究188bet怎么注册[1]．为了从所需的特定动物数量中获得最大的结果，并将研究成本降到最低，通过优化手术程序和设备来减少可变性是至关重要的。使用和处理用于实验室实验的小动物也需要遵循严格的动物福利和预防感染的指导方针。遵守这些指导方针将增加可重复性，但也会增加成本，因此整体工作效率是重要的。本报告将进一步讨论有关中风和癌症发病的研究实例。手术研究的典型工作步骤如图1所示。

为了更好地了解和开发治疗影响人类的疾病和健康问题的方法，例如癌症、心脏病、中风、神经退行性疾病、肝病、关节炎、糖尿病、肥胖症等，啮齿动物和小动物经常被用作这些研究的模式生物。通常用于实验室研究的啮齿动物和小动物是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、野兔等。这些啮齿动物/小动物与人类在解剖学、组织学、激素和遗传上有显著的相似之处，这证明了它们可以作为模型生物［2－3］．此外，还有一些实际的原因，例如，啮齿动物和小动物的器官和腺体适合用于疾病、癌症和中风研究的体内和体外操作和技术，而且它们的生命周期短。

使用实验动物进行的研究和实验通常受到地方、区域、国家和国际动物福利和保护准则和法律的监管。国际准则的一个例子是指令2010/63/EU[4]欧盟(EU)的成员国。还有几个国际组织定期出版最新的准则和建议:

• 动物福利大学联合会［5］；
• 欧洲实验动物科学协会联合会[6]；
• 实验动物学会/Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS)[7]；
• 美国动物科学学会[8]；
• 动物福利科学家中心(SCAW)[9]；
• 亚洲实验动物科学协会联合会[10]．

许多国家还在国家、区域和地方各级制定了关于动物研究的指导方针和法律。通常情况下，这些指导原则遵循3R原则，这是由Russel & Burch在1959年首次提出的(11 - 12)，即鼓励和支持实验室中能够实现以下功能的方法:

1. 更换:取代在实验室研究中使用动物;
2. 减少:使用更少的动物，但获得相当或甚至更多的有效数据;
3. 细化:减轻或尽量减少可能的痛苦和苦难，并促进动物的福利。

已经证明，为了对所有实验室动物进行高效和经济的研究和研究，重要的是它们被宣布为“特定病原体无”(SPF)。[13]．FELASA协会已经确定了一份病原体清单，如果被研究的动物碰巧感染了这些病原体，它们会对实验结果产生重大影响[14]．事实上，在许多情况下，结果往往是不可复制的。此外，啮齿动物和小型动物通常不会从这些类型的病原体感染中恢复，因此确保动物的围场没有这些微生物是很重要的。无论何时，在没有经过SPF认证的动物身上进行实验，都有可能被认为是不可复制和无效的。这样的结果将不被国际期刊接受发表，也不会对提高实验动物科学和人类疾病研究领域的知识或技术水平做出任何有价值的贡献。

在这种情况下，小动物的转基因菌株，通常是老鼠或大鼠，应该从一个设施转移到另一个，转移的动物也必须是SPF级的。当老鼠和大鼠在笼子里运输时，它们总是有可能在运输过程中的某个时刻接触到野生老鼠或它们的残留物，无论是通过火车、卡车还是飞机。188金宝搏的网址这种接触可188金宝搏的网址能导致被运输动物的病原体感染。将转基因小鼠或大鼠转移到另一设施而不受污染的风险，通常有两种方法:

1. 使转基因雌性小鼠或大鼠，或更简单地使其卵母细胞(未成熟的卵细胞)受精，然后将产生的胚胎转移到目标设施中健康小鼠或大鼠的子宫中;或
2. 利用转基因雄性小鼠或大鼠的精子在目标设施中对健康的雌性小鼠或大鼠进行体外受精(IVF)。

小型动物模型有机体，如小鼠，维持费用昂贵，因此不能大量饲养。保持这些动物的笼子和设施的卫生，以维持它们的SPF值是非常劳动密集型和昂贵的。此外，由于上述指导方针和规定要求每只牺牲的实验动物都要报告，因此，尽可能少地牺牲动物更有效和更经济。因此，必须优化每只动物所做的工作，以避免浪费和过高的成本。

• 动物的目标解剖区域的清晰视图很重要——通过适当的光源和高透射光学在显微镜视野内的明亮照明来实现
• 动物解剖的足够大的区域必须用显微镜观察→用目镜或照相机获得大视野(最多23毫米)。
• 需要足够的空间在显微镜下使用手术器械→需要大的工作距离(高达20厘米)
• 在显微镜下，任何物体都不能阻挡你的手和器具，工作时舒适的头部和坐姿对避免颈部、背部和手臂的压力很重要，有符合人体工程学的装置和附件很有用
• 当在通风柜或加热板或衬垫上对动物进行研究时，显微镜在动物上方的精确定位应该很容易，需要一个足够坚固的支架，以最大限度地减少振动
• 多功能和易于设置的显微镜配置节省用户的时间，减少压力，并允许它用于多种任务

中风是一种所谓的"生活方式疾病"或"文明疾病"[15]．中风后患者的预后将取决于其严重程度和快速治疗和药物的可用性。最近的研究表明，某些治疗方法可以帮助中风患者，如冷却患者，抗凋亡物质治疗，等等(16 - 17)．这些结果部分基于临床研究。公众对这类疾病的研究非常感兴趣，因此经常有足够的资金用于研究。大鼠和小鼠无疑是实验室研究中使用最多的哺乳动物模型有机体。它们不仅体积小，在实验室环境中相对容易维护和照料，而且在一个多世纪以来对这些模型生物的许多研究中也记录了丰富的知识和经验。通用的指南和方案确保了高重复性，并允许使用不同方法的中风研究之间的结果进行后续比较。

首先，通常在动物身上产生人工中风，通常是大脑中动脉闭塞(MCAO)。(18 - 20)．中风研究可以在大脑动脉永久闭塞(关闭或关闭)或再灌注(血流恢复)的情况下进行，甚至可以同时进行。通常，中风会导致一个或多个脑部病变。中风后，一些动物接受真实治疗，另一些接受模拟治疗，模拟治疗结果作为对照研究[21]．评估中风恢复情况的方法是在中风发作后的一定时间间隔内进行适当的实验，以确定行为的变化和任何脑损伤的大小(22日)．下面的图2和3显示了一个使用徕卡立体显微镜进行中风研究的潜在手术设置的例子。

图2a和2b由M. Brown、M. Sixt、陆集团奥地利科斯特纽堡科学技术研究所。图3由K. Deligkaris, R. Brownstone，索贝尔运动神经科学与运动障碍学系英国伦敦大学学院神经学研究所。

如上所述，科学实验中使用动物的指导方针通常遵循3R原则，即细化、减少和替换(11 - 12)．如上所述，每一个牺牲的动物都必须报告，研究人员可能只有有限的动物被授予他们的研究。此外，动物的维护和实验是昂贵的，特别是药物和人员的成本，所以在实验动物的工作效率是很重要的。最后，来自有效方法的可靠结果是至关重要的，因为低重复性会导致怀疑。

188金宝搏的网址徕卡微系统公司提供一系列产品，涵盖啮齿动物和小动物手术的必要任务，涉及:

• 中风
• 神经外科
• 对分离器官的研究
• 实验室方法的培训与教学

使用高质量的光学显微镜，实用和符合人体工程学的支架，以及多功能的集成照明解决方案，用户可以快速和有效地工作。图4至图7所示的一些例子如下:

• 动物手术的一个优势是格里enough型立体显微镜(有两个物镜，参见图8)，提供更大的解剖全景，能够放大特定区域，以及分辨率和聚焦深度之间的最佳平衡(FusionOptics)[22])．A60 S和F是一种极好的解决方案，价格有吸引力[23]带环形光的立体显微镜，LED3000 RL[24]，以及额外的聚光灯照明，LED3000 SLI[25]．

• 用于外科手术的通用主物镜(CMO)型立体显微镜(带有一个共享物镜，参见图8)还提供了更大的动物解剖概述，能够放大特定区域。它们可以安装各种各样的多功能照明，并可在一个有利的价格。例如M50[26], M60[27],或者M80[28]配有LED3000 NVI的立体显微镜[29]或LED5000 NVI[30]附近垂直照明。有时还需要额外的聚光灯照明器。它们可以安装在摇臂支架或F12 I支架上［３１］．

• 在做神经外科手术时，需要对单个神经(例如后肢的坐骨神经)进行活夹，分辨率和工作距离也很重要，M125是很好的解决方案[32]配有LED5000 NVI的大型摇臂支架上的立体显微镜[33]或LED5000 SLI[34]照明。

• 对于那些想要和医疗诊所一样实用、灵活和符合人体工程学的设备的科学家来说，M651是一个不错的选择188bet怎么注册[35]或M320 F12[36]立体显微镜。

在她们的一生中，每8名女性中就有1名会患乳腺癌。患乳腺癌的风险随着女性的年龄增加而增加，并与她的生育史有关。激素和其他信号蛋白在乳腺癌发生中的作用机制仍然知之甚少。发生在乳腺中的激素信号通路可以解释其促癌作用。

乳腺的发育经历多个阶段[37]．在出生时，只有一个基本的乳管树存在。激素诱导乳腺上皮细胞和间充质细胞之间的交流，并调节它们的发育。在青春期，这种调节导致乳腺末梢芽细胞，最终到达“脂肪垫”，在这一点上它们开始形成二级和三级分支。

乳腺上皮组织可以连续移植到清除的乳腺脂肪垫，可达七代[37]．在乳腺组织中表达荧光蛋白(如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白DsRed)的转基因小鼠常用于这类发育研究。目前，乳腺上皮组织的外科移植，即连续移植，是综合测定各种类型细胞再生乳腺组织能力的唯一方法。该方法与不同的基因突变菌株相结合，以确定激素信号及其下游介质的相对贡献，以确定乳腺细胞的再生潜力。该结果对乳腺癌的发生有意义。

需要注意的是，所有在UPBRI、ISREC和EPFL实验室用于癌症研究实验的小鼠都是按照瑞士动物安全指南进行维护和处理的。所有动物实验都经过瑞士沃州伦理兽医委员会的批准。

参考下面图9至12所示的位于瑞士洛桑的EPFL, ISREC, UPBRI的小鼠移植手术和组织分析实验室的图像。

当荧光成像手术切除转基因小鼠的乳腺组织时，表达水平可能非常低。当荧光蛋白像绿色荧光蛋白有意表达接近内源性水平。在实践中，较低浓度的表达绿色荧光蛋白意味着它通常很难被发现。所以对于研究人员来说绿色荧光蛋白荧光检测灵敏度的表达水平接近于原生蛋白的表达水平，可以在发现和丢失组织中具有荧光信号的区域之间产生差异。

当对多代小鼠获得的乳腺组织样本进行荧光表征时，将其与相同的照明和显微镜光学设置进行比较是常有必要的。因此，为了便于回忆和再现，存储这些值对节省时间非常重要。了解乳腺组织的荧光模式可能需要在基底的荧光和透射光之间切换。编程的显微镜控制器，如smartouch或脚瓣，并使用编码显微镜与传输光基，如M165 FC或M205 FA荧光显微镜与TL5000 Ergo光基，可以使这一任务做得更简单。

小动物(如小鼠)手术切除组织的荧光特性可以用M125完成[38]带有荧光模块的立体显微镜(EL6000[39]外部荧光源)。其他选择是MZ10F[40]使用TL3000 ST显微镜［４１］传输光底座，M165 FC[42]显微镜(中档)与TL4000 RC/RCI［４１］透射光底座，M205 FA[43]显微镜(高端)与TL4000 RC/RCI或TL5000 Ergo［４１］光基地。参见下面图13至图15。

MZ 10f立体荧光显微镜:

• 高数值孔径(最大NA = 0.25)，高分辨率(最大1.33 μ m)
• 快速放大变化与变焦光学范围的10:1
• 使用TripleBeam技术可获得高荧光照明和最高荧光信噪比[44]
• 高质量图像与平面消色或平面消色校正目标[45]
• 快速4位过滤器更换系统(FLUOIII)
• 用户保护紫外线辐射暴露

M205 FA和M165 FC立体荧光显微镜:

• 从概览到最精细的细节与变焦光学放大范围16.5:1或20.5:1
• 使用TripleBeam技术获得最高的荧光信噪比(S/N[44]
• M165 FC显微镜的分辨率为1.10 μ m(最大NA 0.3)， M205 FA显微镜的分辨率为0.96 μ m(最大NA 0.35)
• 实现最高分辨率和景深目前可能的三维图像观看与立体显微镜FusionOptics[22]可用M205 FA显微镜
• 具有平面消色差或平面消色差物镜的高质量图像[45]
• 由于仪器编码，容易获得重复性的结果
• 用PLAN对浸没或嵌入的标本进行无变形观测7月2.0x CORR物镜，可以消除折射率不匹配[46]
• 当使用全自动M205 FA显微镜做复杂的实验时，完全舒适和易于使用
• 快速4位过滤器更换系统(FLUOIII)

本报告向从事发育生物学或医学研究(如中风或乳腺癌)的小动物(如小鼠、大鼠和仓鼠)的科学家和技术人员提供不同的手术显微镜设置。188bet怎么注册该报告的一个主要目标是在效率和成本效益方面帮助改进动物外科的常规工作步骤。由于每个实验室的需求可能不同，可以使用一系列配置和仪器来处理工作步骤中的特定任务，甚至可以用一台仪器完成更多的任务。根据不同实验室的经验，给出了工作步骤的有用信息。当在发育生物学或使用小动物(如老鼠)的医学研究实验室中建立外科研究设施时，该报告可以作为非常有用的参考或指南。188bet怎么注册

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