膜片钳技术

从Luigi Galvani在18世纪的开创性工作开始^th埃米尔·杜波依斯·雷蒙德，约翰内斯·彼得Müller和赫尔曼·冯·亥姆霍兹的作品^th本世纪以来，膜和细胞的兴奋性一直是神经系统研究的重点。阿兰·劳埃德·霍奇金和安德鲁·赫胥黎于1952年利用电压钳技术揭示了动作电位的离子通道事件，并因其杰出的工作于1963年被授予诺贝尔生理学和医学奖。

当时，电压钳只能应用于较大的细胞，因为需要锐利的微电极来穿透细胞膜。在20世纪70年代末，Bert Sakmann和Erwin Neher改进了电压钳技术，第一次解决了穿过青蛙骨骼肌膜片的单通道电流。他们还被授予诺贝尔生理学和医学奖(1991年)。下一个突破是1980年Bert Sakmann发明的giga密封，它极大地提高了信噪比，允许记录更小的电流。

电生理学最初在特殊的生物物理实验室发展，现已扩展到基础生物学和医学研究，并成为研究神经系统中单个细胞或整个细胞网络行为的最重要工具之一。188bet怎么注册

膜片钳技术允许对小组甚至单个离子通道进行研究。因此，在神经细胞、心肌细胞和肌肉纤维等易兴奋细胞的研究中具有特殊的意义。

单个离子通道每秒可传导约1000万个离子。然而电流只有几个皮安。记录这个数量级的电流不仅对研究人员，而且对设备都是相当具有挑战性的。原则上，端钝的薄玻璃或石英移液管被密封在薄膜上(图2,3)。

吸力用于帮助开发gigahm范围内的高阻力密封。这种紧密的密封在电上隔离了膜贴片，这意味着所有流经膜贴片的离子都流入移液管，并由连接到高灵敏度电子放大器的氯化银电极记录下来。用浴电极来设定零电平。

为了防止膜电位的改变，放大器产生一个类似流过膜的电流的补偿电流，作为负反馈机制(图1)。

测量细胞的膜电位并与命令电位进行比较。如果命令电位和测量值之间存在差异，则会注入电流。这个补偿电流将被记录下来，并得出关于膜电导的结论。膜电位可以独立于离子电流操纵，这使得研究膜通道的电流-电压关系成为可能。

根据研究兴趣，可以使用不同的配置。在cell-attached模式下，膜贴片完好无损(图3)cell-attached模式是loose-patch．在这种情况下，移液管与薄膜不是紧密密封的，只是松散地附着在薄膜上。该模式常用于记录神经元细胞的动作电位。其优点是细胞质的组成不受影响。然而，另一方面，细胞内的环境是无法控制的。

通过补片吸管应用成孔剂(通常是抗生素)会导致穿孔修补这样既保证了离子的连续性，又保证了细胞内的蛋白质不会被移液管溶液冲掉。最常用的膜片钳模式是全细胞模式(图3)。为了达到这一模式，短暂施加强吸力会破坏膜片。移液管内部与细胞质相连。这种方法用来记录整个电池的电势和电流。在全细胞研究人员可以在两种配置中选择:电压箝位模式，电压保持恒定并记录电流;电流箝位模式，电流保持恒定并观察膜电位的变化。

此外，也可以只记录一小块而不是整个细胞的电流。这增加了录制单个频道的机会。贴片可以在贴片移液管内部朝向两个不同的方向。实现由内向外在这种情况下，细胞膜的胞质表面被暴露出来。这通常用于研究单一通道的活性，其优点是暴露在细胞内表面的培养基可以被修改。

如果目的是研究细胞外线索(如神经递质)的影响，那么外部配置(图3)。在这种情况下，移液管在全细胞结构，导致薄膜破裂和重新排列。在这种结构中，细胞外表面被暴露出来，因此细胞外线索很容易被应用。

膜片钳实验可以在培养细胞、急性分离细胞或急性振动器切片上进行，这使得研究细胞在自然环境下的电生理特性成为可能。感兴趣的离子通道也可以在普通细胞系中分离和异质表达(如HEK293, CHO, LNCaP)。

根据样品的不同，需要倒置(培养细胞)或直立固定台显微镜(切片)，并有稳定的平台。如果研究急性切片上的细胞，红外线迪拜国际资本建议对膜进行可视化。显微镜应放置在防振台上，因为任何移动都可能对移液管与膜之间的密封造成致命的伤害。

需要一个显微操纵器来精确地移动移液管。非常精细的吸管是通过加热和拉动小的玻璃或石英毛细管形成的。移液管尖端的直径约为1µm，它所包围的膜贴片只包含少数甚至只有一个离子通道。移液管的尖端在微锻造中进行热抛光，以在膜上获得高电阻的密封。移液管充满一种类似于细胞外溶液或细胞质的溶液，这取决于记录模式。移液管安装在一个显微操纵器上，可以精确地向细胞膜移动。

为测定电流的电导，用氯化银丝。电解槽电极，也是一根氯化银丝，设置为零电流值。一个带有低噪声晶体管的差分放大器连接到计算机上进行数据采集和数字化。可以购买特定的软件来控制放大器和分析数据。示波器也可用来监测电流。如果需要，灌注系统可以添加到设置中。物质可以通过灌注铅笔或使用POC(灌注打开和关闭)室应用。

膜片钳实验不仅用于神经科学，还被用于解决各种各样的生理问题。在过去的二十年中，膜片钳记录在非兴奋细胞中离子通道的研究中也变得更加重要。它也是医学研究中一个非常重要的方法，因为许多疾病都与特定离子通道的故障有关。188bet怎么注册在药理学研究中，自动贴片钳用于筛选离子通道修饰的有效物质。

膜片钳记录也可以与活细胞成像方法相结合，如Ca^2＋成像。这里是Ca^2＋-敏感的荧光染料通过贴片移液管涂于细胞上。同时记录膜电流和荧光的变化。类似的实验可以用pH-或Cl进行^-敏感的染料。