2009年3月17日故事

电生理学和深部组织成像新标准

神经和肌肉细胞的功能依赖于通过离子通道的离子电流。这些离子通道在细胞生理中起着重要作用。研究离子通道的一种方法是使用膜片箝位。这种方法可以详细研究离子通道，并记录不同类型细胞的电活动，主要是可兴奋的细胞，如神经元、肌肉纤维或胰腺的细胞。贴片钳技术是由Erwin Neher和Bert Sakmann在20世纪70年代和80年代开发的，用于研究活细胞中的单个离子通道。1991年，他们获得了诺贝尔生理学和医学奖。钳片技术是目前电生理学领域最重要的技术之一。

作者

伊姆特劳德施泰因梅茨博士。

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主题和标签

大视野和高放大率

在膜片钳实验中，玻璃吸管和细胞膜之间形成紧密的密封。这种安排使得小电流和电压的记录参与神经元的活动和其他细胞(图1)。一个大野外观测是必要的为了找到感兴趣的区域在一个标本,例如在活老鼠的大脑,大脑生活片,胚胎等。此外，重要的是能够看到详细的结构，以便能够准确地放置样品中的移液管和电极。

徕卡DM6000 CFS结合了新的高NA/低倍物镜HC X载脂蛋白L20x/1.0 W，放大率变换器位于CCD相机模式。这种组合允许在保持大观察场的同时快速概述样本。此外，通过使用不同的倍率变换器可以容易地改变观察场。使用20x目标实现大视野。为了识别单个细胞，可以使用4倍放大倍率变换器。因此，使用目标和倍率变换器，可以容易地将移液剂放置非常靠近电池（图2）。如果需要更高的分辨率，则对于神经元刺的调查，系统可以切换到共聚合扫描模式。

图1：膜片钳技术的原理。a）向移液管施加压力以穿透组织。b）应用抽吸以与电池形成紧密接触。a）和b）改编自Stuart等人，1993年）。c）将贴片电极连接到神经元上以记录电压信号。刺激电极可靠近树突放置，以通过电压脉冲进行细胞外刺激。d）获得全细胞形态的步骤：接近细胞体（在细胞上），释放压力形成千兆密封，短暂188金宝搏的网址的抽吸破坏膜（全细胞），细胞可以充满染料或药物。d）来自Th的博士论文。Nevian：“大鼠体感“桶”皮质树突和棘中的钙动力学”，2003年。

图2：细胞的识别：Dodt梯度对比透射光图像，由一名科学家拍摄的小鼠大脑切片CCD摄像机（徕卡DFC360 FX）。要确定大脑切片中的感兴趣层，请概述成像。

单细胞电穿孔

为了研究大脑中的神经元网络，需要具体的单个细胞标记。一种称为单细胞电穿孔（Nevianand Helmchen 2007）的新方法，允许快速和选择性地装载细胞。递送简要的电压脉冲，导致电磁场施加到膜上。这导致小孔隙的瞬态形成;毛孔在几秒钟内关闭。在孔的开口期间在电化学梯度方向上运输带电分子。该方法可用于用钙敏感染料和其他染料载有神经元（图3）。

使用单细胞电穿孔技术，背景染色低于使用细胞内记录电极或贴片移液管加载。单细胞电穿孔技术特别适合于亚细胞钙的功能性成像²⁺-体外和体内动力学。可以装载多种物质以同时获得形态和功能测量。此外，通过使用同一移液管，可以顺序加载多个细胞以成像小的神经元网络。

图3：a）通过单细胞电穿孔法将钙敏感染料加载到特定神经元；用非去扫描检测器（NDD）和透射光同时采集荧光的叠加；b）小神经元网络：大鼠脑切片，第5层，红色：中间神经元Alexa 594，绿色：锥体细胞俄勒冈州绿色Bapta 1（钙敏感），Z=123μm，双光子激发；使用双通道NDD进行检测。瑞士伯尔尼大学生理学教研室Thomas Nevian博士。

关联光学和电气数据 - 和图像

在许多生理应用中，细胞对不同类型刺激的反应是令人感兴趣的。从电强度和荧光强度数据可以看出，细胞的反应需要以同步的方式进行测量和显示。强度数据通常指细胞内钙浓度或pH值。徕卡DM6000 CFS可实现电气和光学数据的同步关联；电压记录与荧光强度数据同步，并自动以图形显示。这揭示了实验进展和在线数据评估的快速和直接概述。此外，图像显示在图形下方，以快速获取有关细胞形态的信息。

数据采集框和Leica触发单元是用于查看强度和电压数据相关的积分组件。从神经元的录制信号通常被放大，然后从国家仪器发送到NI数据采集框（DAQ框），该仪器将信号数字数字。DAQ框连接到触发器单元，允许与扫描过程同步。它还连接到PC，以便可以显示相关的光学和电气数据以及图像。

心肌细胞中的电流和钙

通过使用贴片夹紧（Heka EPC -10双），通过触发脉冲制度刺激曲折敏感染料氟霉菌的钙敏感的染料，由触发脉冲制度刺激。使用荧光成像和电气记录测量对细胞内钙浓度和离子电流的心肌细胞反应。Patch CLAMP安装上的刺激协议与使用跳闸钳安装触发器上的触发器同步，以将事件标记在时间轴上的单个帧中。记录线触发器以具有图像扫描，荧光信号强度和电池的电响应的确切相关性（图4）。这些触发器由扫描头自动生成。这意味着每当扫描线时，它会记录其相应的触发脉冲并以定量图表显示。使用Leica DAQ框完成图像和触发脉冲的同步。

图4：文本中描述的实验量化。强度图（顶部）、电气数据（中部）和图像（底部）在心肌细胞膜片钳实验期间记录。细胞受到不同脉冲方案的刺激，并在ROI内测量离子电流和钙信号强度指示的反应。下图显示记录的电流（紫色）、刺激触发脉冲（红色）和线触发（绿色）。

多光子显微镜和外部探测器

生理学应用中的一个主要挑战是对组织深层细胞的研究。多光子显微镜为解决这一挑战提供了几个优势。较低的光散射、对焦平面的限制激发和漂白以及较低的光毒性是多光子显微镜能够实现深层结构可视化的特性。例如，大脑切片高度分散，通常切成几百微米厚的切片。因此，使用标准共焦显微镜对脑切片成像是非常困难的。由于光子收集效率的提高，较厚的样品可以使用多光子显微镜成像。

在共焦显微镜中，针孔孔径可以抑制离焦荧光和散射光。由于探测器看不到散射光，因此很难对像厚脑片这样的高散射光组织成像。然而，在多光子显微镜中，不需要共焦针孔来阻挡失焦光，因为所有荧光都来自焦点。试样发出的光不需要再次通过显微镜。因此，可以将探测器放置在尽可能靠近试样的位置，以便收集散射光子。通过这种方式，与共焦显微镜相比，获得了显著更高的光收集效率。

外部非降临的探测器（NDDS）是用于从聚焦和散射光收集发射光的PMT S（图5）。NDDS是包含用于检测两种或四种不同荧光信号（4通道NDD）的PMT的盒子。要分隔信号，可以使用多个过滤器多维数据集，可以将其引入到探测器框中。

图5:配备外部探测器的徕卡DM6000 CFS系统。图像:在300 μm厚的活体小鼠大脑切片上选择性标记的神经元红外光谱光。活体大脑切片上的两个神经元被标记为俄勒冈绿色Bapta 1。用rworld和TLD检测相同的荧光。TLD显示明显更亮的信号。瑞士伯尔尼大学生理学研究所Thomas Nevian博士提供。

荧光和高对比度透射光成像

厚脑片中未染色的神经元是相位对象。为了使它们可见，有必要将它们的相位梯度转换为振幅梯度。实现这一点有不同的方法。一种是利用差分干涉对比度(DIC)，这需要光束路径中的棱镜和偏振滤波器。因此，当透射光和荧光一起成像时，由于光路中的光学元件，光子收集效率降低。

红外扫描梯度造影剂(SGC成像)——也称为Dodt造影剂——是另一种用于显示厚散射组织中未染色细胞的方法。这是Hans-Ulrich Dodt (Max-Planck Institute, Munich, Germany)开发的一种特殊光学系统。在这种技术中，可以特别调整对比度，以突出显示不同的结构(水平或垂直)。

使用Dodt梯度对比度方法，光束路径中不需要光学组件以获得高对比度和高分辨率图像。这里，显微镜阶段和灯座之间的透镜系统重新图像冷凝器的孔平面。空间滤波由位于照明光束中的四分之一环执行。在环离开之后，放置扩散器以在冷凝器孔上产生倾斜照明。光挡块大部分照明光并且仅使用照明光锥的一部分。因此，在切片和油浸入式冷凝器中产生较少的晶千，例如，使用1.4 NA，可用于高分辨率图像。可以调节到空间滤波器的方向和扩散器相对于空间滤波器的距离。

创建的对比度非常强烈，图像看起来与DIC图像。利用透射光检测器或所谓的Dodt检测器检测Dodt梯度对比度图像。Dodt探测器的PMT值较高红外光谱-灵敏度(至…900 nm)相比常规pmt。徕卡DM6000 CFS系统配备NDDs和Dodt检测器，使用时可以同时检测荧光和透射光红外光谱励磁。它提供最高的光子收集效率，因为光束路径中没有光学组件。这也有助于许多生理学应用，例如，光学引导贴片夹紧（图6）。NDDS也适用于检测二次谐波产生信号（SHG）（图7）。使用时，Dodt梯度对比度在相机和扫描模式下工作红外光谱兴奋。它也可用于可见光激发，但对比效果可能不太明显。

图6：具有Ca的锥体神经元单细胞电穿孔的时间推移序列²⁺指示器俄勒冈绿色BAPTA-1：荧光通道（非降临探测器）和传输信道同时采集时覆盖红外光谱光以280毫秒的间隔拍摄的图像。在第一帧中，示意图说明了实验设置：10毫秒内发出–15 V的单脉冲（Nevian和Helmchen，2007）。扫描梯度对比的优点是显而易见的：它很容易同时观察细胞结构和荧光染料的装载过程。

图7:小鼠心脏被切除，随后在该器官1毫米厚的切片周围铸入2%琼脂糖凝胶。双光子激发采用840nm。用Syto13(绿色)标记细胞核。左:总图，可见心肌细胞的细胞核。细胞核的“线”属于心肌细胞周围毛细血管中的内皮细胞。红色中可见毛细血管中胶原蛋白的二次谐波信号。模糊的红色背景是心肌细胞的自身荧光。右图:放大图像，胶原蛋白的二次谐波产生信号及其与内皮细胞的联系更加清晰可见。荷兰马斯特里赫特大学生物物理学博士Marc van Zandvoort提供。