与新的徕卡TCSsp5x及其白光激光光源用户可在多达5个光谱共聚焦PMT通道中完全自由选择探测区域。有源声光分束器国内企业允许从白光频谱中的任何位置选择最多八个同时线（图1）。最佳地调节激发线至样品 - 以1nm为单位 - 减少交叉激励并最大限度地减少样品损伤（图2）。系统精确地适应任何现有或未来的荧光染料。凭借200纳米可自由调谐的激励线，可以调整它以提供任何可用染料的最佳激发。这种灵活性对于使用各种样品和各种染料提供数百种用户的核心设施至关重要。188bet官网1
图2:直观的界面让扫描更加自由和灵活:
- 激发线可以很容易地选择到任何波长与1纳米的精度
- 通过液晶控制面板调谐，可以在扫描时选择激发光
- 易于直观的界面使徕卡TCSsp5x完美的基本和高级用户
- 接口允许轻松访问所有扫描参数的超连续和固定激光线
调到最佳兴奋状态
如果比较传统激光器的激发谱和可用的发射谱线，这种差距是明显的:大多数染料不能在其最大截面的位置被激发。像Alexa 488这样的普通染料，虽然它被命名为“488 nm”染料，但在500 nm处激发最大，而在488 nm处的吸收只有75%。徕卡TCSsp5x允许用户无级调节励磁，不管荧光色的名称是什么。因此，荧光染料可以在其最大横截面被激发，对于Alexa 546，这将是561 nm(图3)。
然而，这并不一定是激发的最佳位置。为了防止激发光进入探测器，必须在激发光和被采集的发射带的蓝边之间保持一定的“安全距离”。如果Stokes位移相当低，那么用于发射收集的残差窗口可能会切断相当一部分可用光子，这是不可取的。因此，有时确实有意义的刺激染料在蓝色范围的峰值(Alexa 488情况下)和补偿较低的吸收增加激光强度。
可调激发和可调发射的组合操作可以帮助找到激发和发射的最佳设置:一种软件工具可以在增加激发波长(激发扫描)时获取图像，并自动调整发射波段的蓝色截止，例如总是在激发波长10 nm处，以防止反射光进入探测器。
轻松减少串扰
具有多次荧光的常见挑战是甚至通过窄线的激发，不仅会激发靶向染料，还会促进样品中的其他染料。在大多数情况下，这不想随着各种频道的分离患有一些应用程序的交叉激发，就像烦恼实验，很难工作。在这里，可调谐波长的白光激光源是一个简单的治疗交叉激励。较长的波长激发可以移出蓝色染料的吸收。在这里，通过拨号激发和调整发射频带，可以很容易地实现减少交叉激发和高效发射收集的交互式优化——仅通过几次扫描在线。
如果分离仍然没有优化，系统还提供连续扫描:即记录第一次激发的一条线，然后记录下一次激发的同一条线，以此类推。此外,SP.可以指定作为可调谐设备的检测器，以收集足够窄的带，以用于发射侧的最小串扰。如果上述程序仍然不提供最佳分离，则还实施了用于染料分离 - 发射或激发的线性解混。
优化的罚款
例如，a烦恼AB (烦恼受到受体漂白）实验烦恼描述对Alexa 488和Alexa 568。这只是可能的长名单中的一个烦恼成对，但常用。如果没有更好的选择，则采用543 nm的HeNe激光线对受体进行漂白。根据官方公布的数据，供体的吸收足够低(< 2%)，不影响受体漂白。实验如上所述进行，结果没有检测到供体的增加，因此可以得出结论，这些蛋白质没有“共定位”，而且至少相隔10纳米。用超连续共聚焦法测量供体的激发光谱时，发现在543 nm处的吸收确实高得多，约为11%。当将激光调至580 nm时，供体的放射量显著增加。三分之一，相当于33%烦恼效率。580 nm距离供体激发足够远，因此供体在接受体漂白过程中没有漂白，在漂白后会发出更多的荧光烦恼合作伙伴。在之前的实验中没有增加，原因是应用于受体漂白的激光使供体漂白(图4)。
图4:烦恼AB测量。烦恼效率是通过受体光漂白后供体放射量的增加来衡量的。在左边用传统激光器的例子中，供体发射没有增加(左边一行的绿色图像)。右边显示了供体荧光的强烈增加，使用WLL调谐激发受体(courtesy: Caorsi V, Diaspro a, Genoa)。
励磁特性原位
作为快速可编程线选择器的白光激光源与AOTF组合提供了从染料产生激励光谱的非常直接原位．当扫描仪在每个l-位置拍摄图像时，该软件允许自动增加激发波长。标准操作将保持预设的发射频带;结果是染料作为波长函数的激发依赖性的一个直接测量。第二种操作模式将与激发同步移动发射带的蓝边，以始终记录最大可用的荧光。这对于筛选新的或未知的染料以找出最佳的激发发射设置尤其有价值。通过将感兴趣的区域绘制到记录的图像中，可以很容易地评价激发光谱。该软件将提供所有区域的荧光图。由于测量是直接在样本中进行的，结果比公布的数据更可靠。可以测量一系列不同溶剂条件下的光谱，以找出光谱变化，例如在不同的pH值水平下。
荧光蛋白激发光谱原位
通过激发扫描检查一组新的荧光蛋白。数据可用于优化激励并在与这些FPS记录图像时缩小串扰。此外，计划时需要此信息烦恼对。一般来说，我们也可以在控制条件下研究活细胞荧光参数的变化(图5)。
图5：用WLL激发拍摄和激励扫描的发布数据的比较（礼貌：荷兰癌症研究所，阿姆斯特丹）。
λ2-地图上的蓝藻在罗马地下墓穴
作为一个例子，测量生命变性肌菌的荧光空间。标本是一种蓝藻膜，在罗马的普通Appia Antica的基督教蛤蜊中收集。微生物群落由不同的丝状和酸杂菌蓝藻物种与细菌一起形成。蓝细菌细胞质的光谱差异是由于三种主要类型的光合色素中的内在含量，叶绿素，植物胆素和类胡萝卜素。这些颜料展示了激发和发射光谱的物种特异性变化，有助于鉴定蓝细菌的类型和生理学。蓝细菌垫被确定为罗马奶纪念碑的驱逐舰。
通过调谐470nm和670nm之间的超连续激光和515nm和720nm之间的发射光谱来从单个光学层取出光谱相关数据。随后通过整个四维序列揭示物种特异性强度模式的感兴趣区域中单个个体分析。强度被标准化和颜色编码以可视化图案：非常明显，两种选定的类型在激励和排放特性方面不同。在蓝色激励时，仅在较长的波长下张力效率，在A型中缺乏600nm和700nm之间的非常显着的发射。可以在较高的频谱分辨率下从数据中找到和评估更多细节（图6）。
图6：激发 - 来自生物膜的荧光发射图。提出了两种不同的蓝藻，并显示出荧光的变体模式。
参考文献
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Borlinghaus R：颜色计数：如何在共聚焦显微镜下解决荧光的挑战。在：Méndez-Vilas A，DíazJ（eds。）：显微镜技术现代研究和教育主题890-899（2007）。