技术描述
自上世纪90年代末首次报道光子晶体光纤以来，超连续谱的产生一直备受关注。它通过抽运超短激光脉冲(皮秒或飞秒)的高度非线性光子晶体光纤来产生相干白光。由于它的广谱，这一光源通常用于光谱目的，它最近也被应用在一个商业显微镜系统:徕卡TCSSP5 X。
装有声光分束器(国内企业)，该系统提供一个可在470到670 nm之间轻松调谐的脉冲激光源，允许在吸收最大时激发一个大的荧光团。以确定世界卫生组织是否是一个合适的来源这部电影实验中，我们运行了一个基于双光子验证的校准协议这部电影测量(1]．值得注意的是，我们测量了该系统的仪器响应函数，并在大约300 ps的半最大值下获得了全宽度，与细胞和组织中的荧光寿命测量完全兼容。然后我们在两个主要领域测试了它的能力这部电影应用:i)互动研究烦恼ii)组织自身荧光成像。为了解决这两种情况，我们采用了以下实验条件:
- 使用徕卡进行终身采集TCSsp5x共聚焦和内部PMT。光子计数使用Becker和Hickl SPC830卡进行，使用SPCImage进行寿命分析。
- 两个激励源用于烦恼测量:Cameleon ultra2 Ti:Sa激光在920 nm (8 mW:物镜后光)和WLL在488 nm。检测带通在500 ~ 540 nm之间，采集时间为300 s。
- 对于康复期的横截面成像，我们也使用了两个不同的激励源:405脉冲激光二极管和WLL。激励和检测带通在第三图中报告。采集时间设置为每幅图像60 s。
多功能性flime - fret实验
徕卡TCSsp5x提出了脉冲微光探测器和具有光谱选择的超快探测器。我们开发的系统还配备了一个光子计数卡(SPC830, Becker and Hickl)和一个Ti:Sa激光器(变色龙超II)，一个最先进的TCSPC实验源。这部电影特别适合于可视化和测量烦恼发生在组织或细胞中纳米级的相互作用的蛋白质之间的。因此，为了验证WLL作为来源这部电影，我们对阳性和阴性进行TCSPC实验烦恼在同一单元上交替使用Ti:Sa和WLL作为激励激光源。如图2所示，两个激发源给出一致的结果并允许定量烦恼测量。这样一来，世界自然保护区就可以作为一个多用途的资源这部电影-烦恼实验。此外，在TCSPC模式下，寿命精度直接依赖于捕获光子的数量。使用该系统，我们可以通过以下两种方法来优化收集光子的数量:i)优化激发波长至荧光团吸收的最大值，ii)选择理想的探测范围，最大的施主发射而不受受体荧光渗出。
多光谱寿命成像显微镜
结合国内企业和光谱选择使用内部PMT，该系统在激发和发射波长选择方面具有很高的通用性。如前所述，相关光谱和寿命测量(SLiM)是一种有前途和强大的技术，可用于鉴别多标记样品，并检测异质和自荧光介质(如组织)内部的分子相互作用[2、3]．荧光探针的使用进一步拓展了研究复杂荧光信号的可能性。事实上，人们现在可以通过调节激发波长来执行多光谱寿命成像显微镜(MSLIM)国内企业)和观察范围(移动内部PMT前的狭缝)。在这里，我们提出了一个使用固定康复片的自体荧光MSLIM的例子。
