使用Cryo共聚焦显微镜靶向核孔隙络合物(NPC)
核孔复合体(NPCs)是连接真核细胞外膜和内膜的大型蛋白质组装体。NPCs由数百个核孔蛋白(nps)组装而成,这些核孔蛋白形成一个中央通道,使分子的选择性核浆运输成为可能:RNA和核糖体蛋白被运输从细胞核在细胞质中翻译的核蛋白、信号分子、脂质和其他分子之间来回穿梭成细胞核。
为了更好地理解npc的结构-功能关系及其生物发生和周转的调节,以最高分辨率研究它们在细胞环境中的结构是至关重要的。图1显示了核膜的低温电子断层图[2].断层扫描显示,蛋白酶体与npc结合,“在细胞核和细胞质之间的门户建立了蛋白质降解的枢纽”(Albert, S. et al., PNAS, 2017年12月)。这清楚地显示了低温电子断层扫描(cryo -electron tomography,简称ET)如何提供细胞结构和分子社会学的见解。但是,如何用低温ET选择性地检测罕见的特定细胞事件,例如发生自噬的npc ?
低温电子断层扫描
Cryo ET是一种专用的透射电子显微镜技术,其中采集一系列倾斜图像并重建观察区域的三维体积(图2)。随着科学技术的发展em.在硬件和软件上,可以达到亚纳米范围的分辨率。为了保持样品尽可能接近自然状态,它被迅速地冻结,以避免破坏性冰晶的形成。产生这种无定形冰的过程称为玻璃化。
Cryo Fib Milling.
只能通过Cryo等直接评估低于300nm厚度的标本。更厚的样品,例如NPC分析酵母中的核,必须通过研磨过程稀释。专用双光束显微镜,包括扫描电子显微镜和聚焦镓离子束(Cryo小谎-扫描电镜),用来烧蚀不需要的材料(图3)。
在铣削过程中,去除感兴趣区域上方和下方的材料,以产生200–300 nm厚度的薄片。通过小谎铣削,无法检查的厚细胞样品的一部分,可用于Cryo等。
低温光学显微镜
为了获得特定的细胞位点,如遭受自噬的NPC,必须确定期间的兴趣结构是必不可少的小谎铣削和冷冻等。由于大多数结构都没有清楚地识别扫描电镜在磨铣前或磨铣过程中,需要一种在低温条件下可视化和定位感兴趣的分子的方法。
为了解决这个问题,Cryo荧光光学显微镜是必不可少的,例如,与之THUNDER成像仪EM Cryo CLEM. 使用基因编码的荧光标记,细胞中的特定靶点可以可视化,感兴趣的结构可以识别和标记。反过来,图像和xy坐标可以在后续的操作中检索em.步骤(图4)。
当然,显微镜硬件必须始终保持样品的玻璃化。现代的宽视场显微镜系统使用非常灵敏的摄像机,即使是微弱的表达蛋白也能被探测到。此外,广域系统的固有挑战,如失焦模糊,可以通过应用最新的计算清除技术来消除。
然而,仅仅检索感兴趣的结构的xy坐标是不够的,为了提高目标结构包含在结果中的可能性,z坐标也是必要的小谎薄板。不幸的是,宽视场显微镜的光轴分辨率有限。
为了提高z分辨率,下一个合理的步骤是使用共聚焦显微镜。放置在中间焦点平面上的针孔可以阻挡离焦的光,从而增加对比度和分辨率,特别是沿着z轴(关于共焦原理的更多信息)。
使用共焦显微镜的三维定位工作流程
以下介绍了在3D低温共焦显微镜中识别荧光靶的工作流程以及如何在低温共焦显微镜中检索荧光靶小谎-扫描电镜他的目标是在决赛中保住自己的位置小谎以更可靠的方式在低温下进行进一步的研究透射电镜描述了。
1.相机概述检查网格质量和目标分布
以评估低温处理的质量em.网格和示例,创建一个摄像机概述图像。使用透射或反射显微镜,可以看到碳箔及其完整或缺陷(图5)。
2.通过高分辨率共焦z叠加获得三维信息
在选择相关立场后小谎铣削时,在这些位置沿光轴创建一系列荧光图像,以获得三维信息。与标准宽场系统相比,为了提高z方向的分辨率,选择共焦显微镜。通过激光,逐点扫描样品,同时只记录荧光发射的聚焦信息。然后将在不同z位置记录的2D图像组合成3D堆栈(图7)。
显微镜系统的轴向分辨率主要取决于所使用物镜的打开角度(所谓的数值孔径)。由于商用的冷冻显微镜使用空气物镜方便用户(不需要浸泡,可能会影响保持样品的玻璃化状态),实际分辨率是有限的。典型的分辨率在xy为200 nm,在z为800 nm左右。
为了能够正确地定位细胞感兴趣的位置,基准珠可以应用于样品作为参考结构,以校准和相关性的荧光和em.三维图像[4].
典型的珠粒尺寸为1μm,完全球形,使其中心坐标的子衍射配合。含有金属的微生物可以通过背部散射的电子更清楚地看出扫描电镜,将它们与大小相似的冰晶区分开来。优先选择珠子,使其荧光发射与实际目标不同,以便更好地识别(图8)。
3.标记基准珠和目标
因为基准是可见的LM和扫描电镜,它们的坐标可以用于在两种模式之间转换旋转、平移和缩放等参数。在共聚焦显微镜中标记的目标坐标可以转化为小谎提高了铣削过程中获得感兴趣结构的概率小谎薄板。
不幸的是,用于精确3D定位的商业软件解决方案尚未开发出来,但基于上述出版物的开源解决方案是可用的(3D相关工具箱).
利用三维相关工具箱,可以加载共焦图像数据,标记目标和基准珠,并自动确定其中心坐标。然后将定义的坐标标记投影到小谎用于铣削的XYZ坐标定义的图像(图9)。
4. FIB铣削
为了将目标区域铣削成合适的薄体积,将两个铣削窗口放置在感兴趣的结构的上方和下方,通过将荧光信号投影到目标区域上可以看到这一点小谎然后应用镓离子束,移除相应窗口中的材料。在一个薄片上可以产生多个薄片em.网格增加了工作流的效率。
5.低温电子断层摄影术
为了以分子分辨率获得样品的结构信息,使用Cryo透射电子显微镜对Cryo薄片进行成像。通过注册扫描电镜和透射电镜Lamellae的视图,倾斜系列采集区域可以基于薄片中含有的靶的荧光信号来定义。然后计算成像倾斜序列以计算地组合以重建单元内部的3D体积。通过平均相同种类的许多单独蛋白的结构信息(子断层照片平均)来实现更好的宏观分离的宏观结构。在图10中,通过Cryo Et成像图9中所示的下薄片。断层照片的所得分割显示核膜与靶向的NUP位置。
总结
在这篇文章中,低温共聚焦显微镜是在低温工作流程中评估玻璃化样品的质量和目标分布的一个重要组成部分em.网格。在低温条件下记录的高分辨率共焦数据使科学家能够在三维荧光下定位感兴趣的结构。三维体积可作为相关方法的参考,以检索图像中的目标结构小谎-扫描电镜对于铣削,随后在低温下进行电子断层扫描透射电镜以获得目标在其原生细胞环境中的高分辨率表征。
致谢
我要感谢Julia Mahamid博士,Kar Ho Herman Fung博士为本文提供的图片和反馈,以及整个Mahamid团队,特别是Xiaojie Zhang博士和Jenia Zagoriy博士对低温共聚焦应用的持续支持和卓有成效的讨论。