故事

晶体清晰的低温光学显微镜图像

THUNDER计算清除如何提高低温电子显微镜的目标识别

这篇文章描述了如何计算清除低温光学显微镜图像提高了低温电子显微镜细胞目标的识别。

人类知道许多疾病。为了找到有效的治疗方法,必须研究健康和不健康人体的潜在细胞机制。
低温电子显微镜工作流程的最新发展使细胞蛋白质社会学的3D数据能够以低于1纳米的前所未有的分辨率获得。
为了提高生成所需数据的工作流程的可靠性,低温光学显微镜是检查样品质量和识别靶点的基本工具,特别是对于低温电子显微镜,但对于低温层析成像来说。在这里,我们描述了如何提高低温光显微镜图像的图像质量,以确保更精确地识别靶点。

作者

主题和标签

低温电子层析成像工作流程以及为什么低温光学显微镜至关重要

有关人体生理和病理的许多科学问题只能通过研究细胞的内在机制来回答,它们是任何功能性组织、器官和整个机体的基础。

为了了解不同细胞类型在健康和病理生理条件下的功能,确定参与的生物分子,如蛋白质,并在分子水平上检查它们的相互作用是至关重要的。

为了达到这个目的,低温透射电子显微镜(Cryo透射电镜)被用来在细胞环境中分解生物分子,其分辨率达到前所未有的1纳米以下。通过这种方法,单个蛋白质可以在没有任何标记的情况下被识别,“仅仅”通过它们的形状。此外,甚至不同的构象和它们在细胞质内的分布也可以被区分。

作为先决条件,必须使用复杂的技术(玻璃化)对试样进行冷冻固定,以避免破坏性的冰晶形成。与其他固定技术相比,蛋白质尽可能保持接近自然状态。然后,可以在低温环境中直接评估薄试样(小于300nm)透射电镜.通过倾斜样品,可以创建并重建观察样品体积的三维数据集,以获得感兴趣的相关蛋白质的三维分布(图2,冷冻电子断层扫描)。

为了观察样本的“较厚”部分,样本必须变薄。除冷冻超显微切割外,聚焦离子束(小谎使用专用的冷冻扫描电子显微镜铣削是最佳方法。两个离子束窗口的定位方式是在感兴趣的区域形成一个厚度约为200纳米的薄冰片(片层)。这样,即使是不能被研究的部分标本也可以被Cryo ET获取(图3,小谎铣)。

由于工作流程繁琐,需要许多步骤,而EMs上的材料和成像时间昂贵,因此在早期阶段确定样品质量和网格上目标的存在至关重要。此外,一个主要挑战是找到精确的研磨位置,以确保片层包含蛋白质有意思。

为了克服这些挑战,低温光学显微镜是工作流程的一个重要组成部分。使用低温光学显微镜可以检查样品的质量,最重要的是,可以通过使用基因编码的荧光标记确定感兴趣结构的位置(图4)。

这些标记物可以被选择性地可视化,并显示任何感兴趣的结构在2D和3D中的位置。将荧光和扫描电镜图像可以分配潜在的铣削位置(相关光镜和电子显微镜,克莱姆).

尽管出现了许多挑战(样品的安全低温转移,冷部件上潜在的水凝结,低温下的物镜使用…)商业低温光显微镜是可用的。

低温光显微镜和去雾

188金宝搏的网址徕卡微系统公司提供了一种专用的低温光显微镜,THUNDER成像仪新兴市场冷冻克莱姆,它配备了最新的LED技术和高度灵敏、最先进的科学仪器CMOS相机(图5)。

通过遵循软件工作流,完整的样本持有人的概述(新兴市场网格)可以在不到一分钟内创建,并且可以检查网格上支撑膜的完整性。在第二步中,对目标荧光信号的分布和后续处理的合适区域进行定位小谎铣削可以确定。

不幸的是,尽管宽视场显微镜是一种非常敏感的技术,因此非常适合于低温成像,但在图像中仍然可以观察到背景噪声。该背景主要来源于样本的焦外区域,显著降低了系统的对比度和潜在信噪比。记录的图像通常显示出雾霾,可能不能提供适当目标感兴趣的结构所需的细节水平。

为了解决这个宽视场问题,徕卡微系统公司开发了一个全新的成像系统系列188金宝搏的网址——THUNDER成像仪,它利用计算清除作为核心技术。每次获取图像时,对失焦背景进行检测和去除,从而直接获取感兴趣的信号。同时,在聚焦区域,试样特征的边缘和强度仍然存在。

特别是生物样本,背景通常不是恒定的整个图像。它在视场上的变化很大。计算清理会自动考虑到这一点,使聚焦信号立即可见。

THUNDER Imagers提供三种模式供选择:

  • 即时计算清理(ICC)
  • 小容量计算清理(SVCC)
  • 大容量计算清理(LVCC)

ICC对应于上文所述的计算清理。
SVCC和LVCC是计算清理和基于决策掩模的3D反褶积的组合,用于薄样本(SVCC)或厚样本(LVCC)。反褶积方法的自适应图像信息提取遵循从LIGHTNING演变而来的概念,Leica Microsystems的自适应反褶积方法最初是为共聚焦显微镜开发的。188金宝搏的网址

LIGHTNING使用决策掩模作为基准参考,为图像系列的每个体素计算一组适当的参数。结合广域点扩散函数(PSF), LIGHTNING的功能可以转移到广域探测(更多信息可以在这里找到)。

使用THUNDER提高分辨率

将小体积计算清理(SVCC)应用于单个、无重叠、衍射受限的目标,可以提高分辨率。在给定的例子中,单个直径为40 nm的珠子被成像(100倍放大镜,NA 1.44),并应用SVCC。与样本相关的结果是,横向分辨率提高了约2倍(使用SVCC/Raw的X域FWHM比值为0.51),轴向分辨率提高了2.5倍(使用SVCC/Raw的Z域FWHM比值为0.39)。

*分辨率增强,定义为点源发射光的表观尺寸。在低于衍射极限的情况下,将两个相互接近的结构分离是不可能的。

用THUNDER成像仪EM cryoclem对玻璃化样品进行成像

由于THUNDER技术首次成功用于在环境温度下对样品进行成像,徕卡专家后来提出了在低温条件下应用这项技术的想法。从宽视场低温图像中去除雾霾是特别有用的,因为它不仅提高了图像质量,而且确保了对后续感兴趣的结构的更可靠的识别新兴市场工作流程步骤(即:。,小谎铣削和透射电镜分析)。

图8显示了使用THUNDER技术(THUNDER LVCC)观察到的酵母细胞在左面板上,我们可以看到细胞壁上绿色自发荧光的离焦雾干扰了核仁的识别。我们可以说,绿色荧光可以从叠加图像中去除,但同时需要细胞壁的可视化来识别未附着的核仁。打雷后,背景烟雾减少,信号保持不变;细胞壁和核仁清晰可见,易于识别小谎研磨的目的。

在不同的试样上进行了THUNDER技术的应用。图9显示了另一个例子:A9细胞被与Phalloidin结合的绿色荧光染料标记。Phalloidin选择性结合纤维肌动蛋白,在真核细胞中起结构作用。在左边的面板中,微小的结构被失焦的光隐藏(见箭头),但是在THUNDER SVCC之后,它们在右边的面板中变得可见。

F-Actin非常适合于THUNDER成像,因为它的薄和纤维结构显示即时改善。结合mCherry标记的F-actin,图10也是一个囊泡结构:TGN (Trans-Golgi Network, TGN)蛋白TGN46,由绿色荧光蛋白荧光。TGN将新的蛋白质导向不同的亚细胞目的地。THUNDER还揭示了这些小泡状结构,同时消除了失焦光造成的模糊。

总结

在本文中,我们展示了徕卡微系统公司的THUNDER成像技术如何使用计算清除技术提高低温条件下玻璃化样品的图像质量。188金宝搏的网址即使是微小的结构也可以通过去除主要由失焦光线引起的雾霾或模糊而变得可见。THUNDER成像技术不仅提高了成像质量,而且有助于更容易地识别后续的结构新兴市场分析步骤。

想知道更多吗?

和我们的专家谈谈。我们很高兴回答您的所有问题和关切。

188金宝搏的网址联系我们

你更喜欢私人咨询吗?

  • 188金宝搏的网址徕卡微系统有限公司
    很遗憾,1700巷
    布法罗格罗夫IL 60089 美国
    办公室电话:+1 800 248 0123
    188bet官网1服务电话:1 800 248 0223
    传真:+ 1 847-236-3009

你可以在这里找到更详细的本地联系人列表。188金宝搏的网址