故事

对称突触-网格蛋白包覆的突触后树突内吞坑

徕卡EM ICE应用笔记-生命科学研究

过程
WT海马神经元以80000个细胞/cm2的密度在6mm蓝宝石盘上镀14天。样品用高压冷冻机(徕卡EM冰),将其安装在含有15% Ficoll 400的胞外溶液的夹层支架中,以评估冰晶的损伤。冷冻固定在毫秒内实现,允许同时固定所有大分子成分。冷冻后,样品转移到含有1%戊二醛、1%四氧化锇、1%毫水无水丙酮的冷冻瓶中,并在自动冷冻取代装置中处理(徕卡EM AFS2).

样品从-90°C逐渐升温至-50°C(增加8°C/h);在-20°C时,样品保存12h,最后加热到20°C(增量5°C/h)。冷冻取代步骤样品与0.1%醋酸铀酰对比1小时后,包埋在EPON中。EPON树脂在室温下渗透,30% EPON/丙酮渗透3h, 70% EPON/丙酮渗透3h, 90% EPON 4℃孵育过夜。

最后,将样品放入装满纯EPON的胶囊中,在60℃下进一步聚合48h。随机选择约200µm的含有细胞的正方形区域,用a徕卡超微切片(徕卡EM UC7),并收集在formvr涂层(0.5%)200目铜网格上。这些切片在蔡司900或FEI Tecnai G20电子显微镜下在120 keV (FEI)下进行进一步检查。使用Veleta相机(FEI, 2048x2048像素)在13.5万倍放大(像素大小0.375nm)下采集电子显微照片(2048x2048像素)。切片与2%醋酸铀酰在毫微水中对比3分钟,然后在水中洗涤,风干和柠檬酸铅孵育(0.15 m柠檬酸铅,0.12 m柠檬酸钠在CO中2免费dH2O) 15秒。

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