FRAP实验的一步一步指南

首先,选择收紧-Wizard选项“TCSSP8”位于用户界面(UI)顶部[图1]。

在向导界面的顶部，工作步骤以按钮的形式显示:“Overview”、“Set Up”、“Bleach”、“Time course”、“Evaluation”(图2)。

概述给出了向导的描述，并解释了在每个步骤中要做什么。

首先,收紧例程与放大描述:
点击Setup按钮(见下图3)来调整漂白前后成像的硬件参数。

请注意：
在TCS配备有混合检测器（HIDD）的SP8系统，建议使用PMT作为选择的检测器收紧实验。在光漂白过程中，感兴趣区域(ROI)内通常会达到高强度水平，这可能会导致HyD探测器关闭以保护它们免受光子过载的影响。由于检测器随后必须被主动打开，照相后漂白序列将丢失，无法进行量化。

如果需要对3D堆栈进行更详细的分析，可以将扫描模式从xyt更改为xyzt(图4)，并随着时间的推移分析整个z堆栈。然后以xyzt模式扫描漂白前和漂白后系列，并可定义其中一个平面的光漂白。

堆栈内的任何平面都可以定义为光漂白。实际z平面的位置（图5;①）将自动保存并显示在UI的底部。PhotoBloach脉冲仅在该平面中执行。在PhotoBloach步骤中没有收购Z堆栈。

根据分子的预期移动性，可以调整适当的采集速度。因此，对于自由漫射分子，应使用1800Hz线频率的双向扫描速度。结合图像格式为256 x 256像素，可以每79毫秒录制图像。

选择顺序扫描(图6)以避免在多通道设置的情况下的串扰。这种扫描模式对于光转换也很有用，例如，像KAEDE或DENDRA2这样的可光转换蛋白质的实验。

为了实现监控和光漂白之间的最高动态范围，在配置/激光菜单中调整氩气激光功率到80-100%范围内(图7)。

对于成像，将AOTF（声光可调滤波器）值设置为低百分比。

如果激发光的量是不够的(例如，在快速获取与共振扫描)，该选项收紧建议使用Booster(图8)，假设系统已经配置了它。一旦激活,收紧助推器选项在整个实验中保持活跃。

如果这个选项是主动的，光束扩展器将从光束路径撤回。因此，物镜的后孔径不再完全充满光(见图9A)。进入物镜的光量是一样的，但是集中在中心的一个点上。光强度大约是2到5倍，取决于物镜(见图9B)。事实上，样品可以用多个光强度(更集中和更少集中的光)使用收紧辅助选项。

如果使用薄单元层，可以将针孔大小设置为2个通风单位或更多。打开针孔提高信噪比，你将收集更多的动力学信息更深入的样品。

请注意：
将强度设置为低于饱和度，但略高于零，因为零设置可能会干扰数据分析。适当的查找表（发光/下光/灯泡）可以帮助调整增益/偏移量。确保为所有实验使用相同的增益设置。为了再现性，建议保存（图10）所有设置设置-,漂白剂- - -时间进程- 现在或在最后一步中的标签。然后，将存储所有硬件设置，包括ROI形状和位置。

点击漂白剂-按钮(图11)设置光漂白参数。在左边，您可以看到所有选项的描述。

首先，选择使用ROI①还是点漂白剂②(图12)。

您可以选择以下任一选项(图13):

允许更快的时间分辨率的整体收紧系列。可以实现线向时间分辨率，而不是帧向时间分辨率。你可以将时间分辨率降低到0.35 ms，因为恢复测量已经在线之间而不是帧之间完成了。这意味着恢复度量开始时尽可能接近零点时间(t0)。

FlyMode结合了photobleach扫描和光漂白后的第一张图像扫描(图14)。利用高激光功率的ROI扫描特性，在前进过程中进行光漂白。在反激过程中，激光强度被设置为成像值(AOTF开关工作在微秒内)。因此，第一幅图像与光漂白帧同时获得。因此，漂白和数据采集之间的延迟时间不到扫描一行所需时间的一半。

对于大多数光漂白应用，我们推荐放大选择。光漂白过程中的扫描场被最小化，更多的光被应用到ROI。

与TCSSP8系统，放大也可以与共振扫描仪。

根据所定义roi的大小，光漂白(条状扫描)时减少扫描行数。当需要多个间隔(例如10个或更多)时，你可以使用这个选项来加速光漂白。此选项可以与放大．

建议在以下情况下使用此选项放大或FlyMode是活跃的。

放大:
通常，ROI外的区域将暴露在背景强度下。如果图像被放大，这种背景强度会导致光漂白。使用“设置背景为零”，暴露的ROI外的区域将没有光。

FlyMode:
当FlyMode激活时，你有一个前向通道和一个回飞通道(见上面)。使用“设置背景为零”的前向通道将在漂白前和漂白后看不到灯光。只有在漂白过程中，前(左)通道才会在ROI内得到光。

通常，光漂白的投资回报率非常明亮，并且在许多实验中，使用光博进行放大，但它妨碍了有意义的量化。相同的是“更改漂白格式”选项有效。对于这些情况，选项“扫描后删除漂白图像”避免了废物数据的累积。

当几个rois应通过相同的激光线暴露时，可以选择此选项。现在绘制ROI进行漂白并定义AOTF值以调整激光功率以进行漂白。

点击ROI配置⑦当个别的激光线应该被几个roi激活。在此之前，你必须取消勾选“所有roi都使用激光设置”。

如果需要非常快速的扫描模式（例如，水介质中的扩散测量），您可以以512×128格式扫描双向扫描，这导致每帧的非常短的时间，即12 ms。在这里建议施加多个光噬框架，例如三个或四个，以施加足够的光线以进行光漂白。

为了弥补由于照明时间过短而造成的光线过少，你可以使用:

• 放大在光漂白期间(用TCSSP8系统，放大可用于共振扫描仪)[收紧放大镜)。
• 这收紧建立中的助推器选项。

你可以使用收紧向导光活化(例如，当使用PA-绿色荧光蛋白)。打开紫外线- 班车然后在光照步骤中使用405激光线代替488激光线。

接下来，选择时间课程（图15）来定义预烧伤数量，漂白和后间隔。具有1800 Hz扫描速度（双向扫描）和256 x 256格式的典型实验可以如下定义：

您也可以通过点击“+”来添加额外的时间表。如果需要，实验可以在运行的中间停止，例如，在漂白后。然后将引导用户进入评估步骤。如果完全恢复的总时间不知道，这个特性特别有用，因为它允许用户在漂白后一旦达到完全恢复(即不再增加强度)就结束实验。换句话说，不需要等待，直到预测帧的数量已经获得。

表1：预析，漂白和后冻结步骤的总帧和帧速率参数。

应调整采集速度以解决具有良好时间分辨率的恢复的动态范围。因此，理想地在恢复的一半所需的时间内获得至少10个数据点。

要做FLIP实验，可以设置漂白剂和第一个漂白剂后步骤之间的重复次数①(图15)。

在检测到荧光强度没有明显的进一步增加之前，应进行初始实验。如果您希望您的roi和时间课程包含在您保存的设置中，您可以在步骤1或最后一步中这样做。点击运行实验开始实验。它自动运行，然后导致评估步骤。

请注意：
如果你用荧光蛋白做实验，使用不同时间刻度的漂白后序列可能会导致时间刻度过渡期间强度下降。在实验过程中改变成像频率可以改变荧光蛋白进入暗态的比例(见下文16)。另一种策略是定义40或50个预漂白间隔，以便在预漂白系列的前10至20个间隔内初始强度下降后达到稳定状态强度。

现在将显示恢复图表(图16)。该图表显示了所有帧roi的平均强度值。这个图表可以通过鼠标右键导出到Excel中。

1. 可以节省实验条件和程序;
2. 报告以XML格式生成数据表;
3. 背景可以减去;
4. 拟合可以应用于数据;

下载

Confocal Application Letter - FRAP with TCS SP8 (pdf, 2MB)