免疫荧光
从用标准免疫荧光协议制备的样品开始，衍射有限的荧光显微镜应该已经提供了惊人的超分辨率图像。为了获得最佳的GSD图像，可能需要增加一抗和二抗的浓度，以达到更高的标记密度。增加标记密度可确保感兴趣的结构被荧光团充分染色。结构的稀疏标记可能导致图像的点状外观。为了减少GSD图像中的非特异性背景信号，可能需要增加阻断样品的时间以及阻断试剂的浓度。建议彻底清洗样品(例如增加清洗步骤的次数和时间)。
对于双色染色，Leica Microsystem188金宝搏的网址s推荐a) AlexaFluor 532与AlexaFluor 647, b) AlexaFluor 555与AlexaFluor 647或c) Atto 488或AlexaFluor 488与AlexaFluor 647的组合。
结构保存
特定细胞结构的保存在很大程度上取决于固定方法。准确的固定方案应根据感兴趣的结构进行优化。对于大多数结构，多聚甲醛/甲醛固定是足够的。少量戊二醛(0.05 % ~ 0.2 % (v/v))和多聚甲醛/甲醛作为固定剂可显著提高结构的保存性。戊二醛能引起朦胧的荧光背景，因此用NaBH铵猝灭4或推荐其他合适的试剂。甲醇固定是微管保存的常见方法，但对其他结构可能不够。
盖玻片
超分辨率成像要求在整个光学系统中都有优异的光学性能，而不仅仅是在显微镜和物镜中。覆盖层是影响成像结果的重要参数。为了获得最佳的超分辨率图像质量，需要一个平坦的封面。
不幸的是，虽然对标准的宽场应用不重要，但并不是所有腔盖产品都能保证最优的平面度GSD。此外，盒式盖套产品可能无法提供高分辨率成像所需的机械稳定性。各自的产品应由研究人员测试其适用性。通常可以通过无应力安装玻璃盖板，例如在专门设计的盖板支架中，获得更好的平整度和高稳定性。
在我们的案例中，我们推荐一种简单而平坦的替代方法盖玻片安装特别为GSD成像量身定制，利用高精度的盖子和硅胶胶来固定和密封标本(见下文)。
嵌入
每个荧光团与其直接环境(嵌入介质)相结合的固有特性决定了基态耗尽能力以及单分子返回率。有了它，包埋介质对成功的GSD成像起着至关重要的作用，必须与所使用的荧光团对齐。到目前为止，下列越来越多的机会是适用的。
PBS包埋培养基1 - MEA
试剂
- β-巯基乙胺(MEA)(如Sigma-Aldrich， # 30070，也称为半胱胺)
- 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
- HCl / NaOH调节pH
缓冲
PBS含有10 mM β-巯基乙胺(MEA)，调整到pH 7.4。将β-巯基乙胺溶解在PBS中，调整pH为7.4。β-巯基乙胺的浓度可以在很宽的范围内变化，以优化GSD图像-可用范围一般在10到100毫米(测试10 / 30 / 100毫米的推荐浓度)。
β-巯基乙胺溶液在使用前必须新鲜配制。或者，储备溶液可以准备和储存在-20°C和新鲜解冻之前使用。冷冻的等价物可以保存几周。
照明
EPI:是的
TIRF:是的
| 激光(nm) | 染料 | 制造商 |
|---|---|---|
| 488 | AlexaFluor 488 | 生活的技术 |
| 488年阿 | σ | |
| Chromeo 488 | 活动主题 | |
| 俄勒冈州绿488 | 生活的技术 | |
| Chromeo 505 | 活动主题 | |
| 532 | 520年阿 | σ |
| AlexaFluor 532 | 生活的技术 | |
| AlexaFluor 555 | 生活的技术 | |
| AlexaFluor 568 | 生活的技术 | |
| 642 | 633年阿 | σ |
| AlexaFluor 647 | 生活的技术 | |
| 阿647牛 | σ | |
| 655年阿 | σ | |
| AlexaFluor 680 | 生活的技术 | |
| AlexaFluor 700 | 生活的技术 |
包埋培养基2 -葡萄糖氧化酶
试剂
- 葡萄糖氧化酶(如Sigma-Aldrich G2133)
- 过氧化氢酶(如Sigma-Aldrich C1345)
- 葡萄糖
- 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
- HCl / NaOH调节pH
缓冲
PBS含10% (w/v)葡萄糖，0.5 mg/mL葡萄糖氧化酶和40 μg/mL过氧化氢酶调节至pH 7.4。
注:建议在安装盖玻片之前准备一个葡萄糖原液和混合试剂。
照明
EPI:是的
TIRF:是的
| 激光(nm) | 染料 | 制造商 |
|---|---|---|
| 532 | 532年阿 | σ |
| AlexaFluor 532 | 生活的技术 | |
| AlexaFluor 555 | 生活的技术 | |
| 若丹明6 g | 活动主题 | |
| 565年阿 | σ | |
| AlexaFluor 568 | 生活的技术 | |
| 642 | 655年阿 | σ |
| AlexaFluor 680 | 生活的技术 |
包埋介质3 - PVA
试剂
- 分子量为25,000，水解88 mol%的聚乙烯醇(PVA)(例如:Polysciences， #02975-500)
- 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
- HCl / NaOH调节pH
硬件
Spincoater
缓冲
在PBS中准备1% PVA溶液。将pH值调整到7.4。
Spincoating
将盖玻片放在喷涂布机上，以大约5-10秒的速度快速旋转干燥盖玻片。3000 rpm。在样品上滴入50 μl的pva溶液，在约。3000转，大约30秒。让pva薄膜干燥几分钟，并安装样品。样品可在室温下保存，用于GSD成像长达3个月。
不需要额外的安装介质。pva薄膜在保护样品。
照明
EPI:是的
TIRF:不可能
| 激光(nm) | 染料 | 制造商 |
|---|---|---|
| 488 | AlexaFluor 488 | 生活的技术 |
| 488年阿 | σ | |
| Chromeo 488 | 活动主题 | |
| 俄勒冈州绿488 | 生活的技术 | |
| 520年阿 | σ | |
| 532 | AlexaFluor 532 | 生活的技术 |
| AlexaFluor 680 | 生活的技术 |
包埋培养基4 -莫维尔
试剂
- 丙三醇(分析纯)
- Mowiol 4-88(如Calbiochem #475904)
- 蒸馏水
- 三
- HCl / NaOH调节pH
包埋剂
- 从6克甘油开始
- 加入2.4 g Mowiol 4-88
- 加入6毫升水。
- 加入12毫升0.2 M的TRIS缓冲液，pH为8
- 搅拌4小时(磁力搅拌器)
- 让悬液休息2小时
- 50°C(水浴)孵育10分钟
- 5000 x g离心15分钟
- 取上清液，在-20℃下等量冷冻
照明
EPI:是的
TIRF:不可能
| 激光(nm) | 染料 | 制造商 |
|---|---|---|
| 488 | 488年阿 | σ |
| Chromeo 505 | 活动主题 | |
| 532 | AlexaFluor 532 | 生活的技术 |
| 若丹明6 g | 活动主题 | |
| 阿647牛 | σ | |
| 642 | 655年阿 | σ |
| AlexaFluor 700 | 生活的技术 |
包埋培养基5 - Vectashield®
试剂
- Vectashield®(例如，病媒实验室，# H-1000)
- 50毫米三甘油
- HCl / NaOH调节pH
缓冲
- 50 mM Tris/甘油缓冲液含有10% Vectashield®调整至pH值7.4。
- 将Tris溶解在甘油中，准备一个50毫米的库存溶液。混合10%维盾®用90%的三磷酸甘油缓冲液。调整pH值7.4。样品可在4°C下保存数周。
照明
EPI:是的
TIRF:不可能
| 激光(nm) | 染料 | 制造商 |
|---|---|---|
| 532 | AlexaFluor 555 | 生活的技术 |
| 642 | AlexaFluor 647 | 生活的技术 |
YFP的包埋介质
GSDIM适用于使用荧光蛋白创建超分辨率图像。荧光蛋白YFP / Venus显示出惊人的结果。此外，其他荧光蛋白也应该使用这项技术(包括绿色荧光蛋白）.为了将有机荧光团的能量与基因编码融合蛋白的优势结合起来(例如，如果没有合适的抗体)，建议使用SNAP-、Halo-或CLIP-Tag等标签。这些标记可以在基因上与感兴趣的蛋白质连接，然后用有机荧光团标记(例如在固定和渗透后)。
下面的水包埋成功地在固定和渗透的哺乳动物细胞中成像YFP:
- 过氧化氢酶SIGMA, C1345 40 ug/mL
- 葡萄糖氧化酶SIGMA G2133 0.5 mg/mL
- 葡萄糖10毫克/毫升
- β-巯基乙胺(半胱胺)1mm
- 用PBS稀释，调整到pH 7.4
越来越多的
188金宝搏的网址徕卡微系统公司建议将盖玻片与样品直接安装在凹陷玻片上。盖玻片应固定在凹陷玻片上，并用双组份硅胶Twinsil密封®(Picodent, Wipperfürth，德国，#13001000)。Twinsil®无毒，快速硬化，可以很容易地去除，例如重新安装样品。
- 加入90 μl水溶液(MEA、Glucose-Oxidase-Mix或Vectashield)®)进入一个干净的凹陷滑梯的腔内。
(PVA、LR-White埋膜:凹陷片空腔。) - 将带有样品的玻璃盖玻片放置在凹陷玻片的空腔上。样品应面向空腔。封面应完全盖住凹陷处。
- 如果在空腔中填充了水埋介质，请确保没有气泡存在。否则小心地取下封面并重复上述步骤。
- 不应该有液体存在的区域，应该被胶水覆盖(Twinsil®）.用滤纸小心地除去剩余的液体。对于嵌入介质1、2和5:确保没有缓冲液从储液槽中浸出。
- 混合Twinsil的黄色和蓝色成分®以1+1的量完全地涂在玻璃盖的边缘，不要直接接触盖。
对于水性包埋介质:用Twinsil完全密封盖片®．
PVA和LR-White包埋介质:将封面封紧至约。75%，其余四分之一打开，以通风，避免样品冷凝。 - 5-10分钟后，双组份胶水硬化，样品准备进行GSD成像。
胶水可以很容易地去除，硬化后不会在玻璃上留下痕迹(例如更换成像缓冲液)。
AlexaFluor®是life technologies™的注册商标。
安装程序
1)吸量管约。将90µl的包埋液(如MEA溶液)注入凹陷玻片腔内。 |
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2)将盛有免疫染色标本的圆形盖玻片置于培养基上，避免气泡形成。 |
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3)轻轻按压盖片以去除气泡(如有必要)和多余的缓冲液。 |
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混合这两种成分- Twinsil的硬化®从搅拌开始。 |
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4)在不浸泡缓冲液的情况下，仔细地从凹陷滑道的储层中取出液体。 |
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5)用双面胶将封面封好®．请勿触摸或移动封面! |
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6)当硬化(约5分钟)Twinsil®用尖轻轻一碰，既不粘，也推不开。 |
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成像技巧
既染色
188金宝搏的网址徕卡微系统公司推荐的组合
a) AlexaFluor 532和AlexaFluor 647
b) AlexaFluor 555和AlexaFluor 647
c) Atto 488或AlexaFluor 488 with AlexaFluor 647
用于连续双色成像。请先成像红色通道(AlexaFluor 647)。188金宝搏的网址徕卡微系统不建议在开始时对绿色/橙色通道(例如AlexaFluor 532)成像，以避免AlexaFluor 647的漂白，这可能——尽管在非常低的水平——由488 nm(或532 nm)激光激发。如果使用其他荧光团对样品进行双染，请检查两个荧光团是否可以在相同的GSD成像条件(包埋介质)下成像，且可以忽略串扰。
图3:红色AlexaFluor 647染色微管和绿色AlexaFluor 488染色网格蛋白的PtK2细胞。马普生物物理化学研究所Stefan Hell教授提供，Göttingen，德国。
使用405纳米激光器
徕卡SR GSD 3D配备了405纳米激光器。通过对样品进行额外照明，可缩短荧光团在关闭状态下的寿命紫外线光。较短的生存期导致处于开启状态的荧光团的增加，因此可用于增加每帧检测到的事件数量。通过保持每帧事件的数量在一个最佳范围内，可以a)有效地检测分离良好的单个荧光团，b)保持获得超分辨率图像的时间短，因为可以在更少的图像中积累所需的事件数量。
在获取双色图像较长的波长通道时，谨慎使用405 nm激光是很重要的!405 nm波长可以激发绿色染料，从而漂白较短波长的荧光团，同时获得较长波长的超分辨率图像。应分别确定每种样品类型的最佳设置。
活细胞的超分辨率成像
最近的报告研究了GSDIM(也称为dSTORM)来成像活细胞。一般来说，使用徕卡SR GSD 3D是可以研究活细胞的，但是光毒性——由于高激光功率的应用——以及观察期间感兴趣的结构动力学应该被仔细控制。
