Cryo-Transmission电子显微镜
解决样品制备过程中的干燥问题和显微镜真空中水分挥发问题的一种方法是在-180°C及以下的特殊容器中检查样品，在冷冻状态下只有最小的升华率。这种技术被称为低温透射电子显微镜TEM)或透射冷冻电子显微镜在过去的几十年里已经成为结构生物学中不可或缺的工具，随着冷冻电子断层摄影术的出现，细胞生物学也成为了不可或缺的工具。
对于本质上足够薄的样品，如分离的大分子复合物、病毒或小细胞，标本准备低温TEM基本上可以简化为一个步骤:通过浸入式冷冻(浸入式冷冻)进行物理固定。本文描述了这种技术的基础和缺陷篇文188金宝搏怎么注册章介绍几个最近的应用。
浸渍冻结
成功显示嵌入冰中的样品的一个先决条件是在如此短的时间内将水分子锁定在合适的位置，不允许冰晶的形成，理想情况下会产生无定形的冰冻(玻璃化)水。在浸入式冷冻的情况下，只有在使用合适的高热导率的致冷剂和快速浸入样品以确保快速冻结的情况下才能实现。合适的低温设备包括液态乙烷、丙烷或两者的混合物［1］仅在熔点以上使用(-183对应。纯化合物为-188°C)。此外，样品中任何一点到暴露在低温源表面的距离必须很短，即样品必须很薄。
冷冻标本载体TEM必须为标本提供良好的支持，但很少的背景，以避免进一步降低典型的未染色冷冻标本的低对比度。它们还必须是导电的，以避免试样充电和有关的问题，如漂移。标准在一定程度上满足了这些要求TEM带有穿孔碳膜的网格，可以是实验室制造的类型，也可以是商业上可用的类型。后者的特点是孔的尺寸和位置非常规则，便于自动数据采集。用辉光放电/等离子体清洗或基质蛋白涂层对栅格进行预处理，可以允许水溶液的均匀扩散或细胞的附着。
基本浸渍冻结,网格由钳固定在一个guillotine-like装置(图1),少量(3 - 5µl)标本的水溶液,和解决方案的主要部分是玷污了滤纸减少残留层的厚度。这个步骤对于玻璃化(见上文)和达到显微镜的电子束可以穿透的厚度都是必要的，对于大多数样品来说，不需要进一步的准备步骤。精确的厚度取决于样品和可用的显微镜，通常是样品允许的厚度，但不超过500纳米的冰层。这也在可以用所述技术可靠冷冻的厚度范围内。
印迹后，立即将样本迅速放入低温培养基中。冷冻后，将标本转移到LN中2在用显微镜检查前几乎无限期地保存。
挑战
一个关键问题是通过足够快的冷却来产生玻璃冰，但同时也要保持冰的非晶态:后者要求样品保持在再结晶温度以下。这可以通过保持网格低于LN来确保2或在一个寒冷的N2气体气氛和预冷却操作冷冻标本所需的所有工具。
另一个主要问题是，湿度在冷冻标本表面凝结，形成纳米大小的冰晶，污染了标本。由于样品将被冷冻成像，作为一个整体(与冷冻替代或德康冷冻切片等方法相反，后者的表面晶体被随后的处理步骤去除)，这种污染将作为高对比度特征在TEM，这是必须避免的。这可以通过一些规定来实现，旨在降低周围环境的湿度和样品暴露在这种环境中的时间:通常，最好是一个除湿的房间，样品应保持在LN以下2在美国，必须避免对样品进行呼吸，所有转移应在干燥(和寒冷)的N2使用清洁工具将空气置于液相上方，显微镜必须通过特殊的防污染装置在物镜区域提供一个干净的真空环境。
然而，即使是完全冷冻的样本，如果在冷冻前没有处理好，也不会产生有意义的结果。一个潜在的问题来源是仪器上样品的温度不受控制，如图1所示:位于含有LN的容器上方一个未定义的位置2时，样品暴露在室温或冷气体中，导致特征状态不良。
在同一类型的仪器上，特别是如果工作在一个湿度较低的房间，如上述建议，溶剂的蒸发可能会出现问题:根据［2］在室温和环境湿度为30%的条件下，水以50 nm/s的速率从薄膜中蒸发。这种溶剂的去除和随后的盐和其他溶质的富集显然会严重影响从水溶液样品中获得的结果。
尽管图1所示的基本工具在经验丰富的研究人员手中产生了非常有意义的结果，但上面提到的许多问题仍然没有解决。因此，实验室已经开始建立他们自己的仪器与环境室和自动印迹机制。不同制造商的商业产品紧随其后(查看[3])，包括徕卡EM全科医生徕卡微系统公司的浸泡式冷冻机，与维也纳IMP/188金宝搏的网址IMBA电子显微镜设施合作开发(图2)。
