病毒膜相互作用
一个建立良好的低温使用案例TEM是分离的大分子、病毒粒子或丝状体的三维重建。一方面，这些方法是基于重复结构的平均——要么是由于大量相同的分子、灯丝上的重复图案，要么是为了减少低温固有的噪声而产生的对称性TEM. 另一方面，三维重建所需的这些复合体的不同视图可以通过（理想情况下）冰中粒子的随机取向或细丝的螺旋性获得。
迪特·布拉斯集团的莫希特·库马尔佩鲁茨实验室（维也纳）对鼻病毒颗粒与脂质膜的相互作用感兴趣，导致颗粒内吞作用的事件[1]。他们决定采用单颗粒重建方法，以使用选自许多显微照片的许多单独的病毒藻（脂质体）获得颗粒对人工膜（脂质体）的三维模型。
对于这类实验所需的许多显微照片的收集，或者对于大量相似标本的网格的冷冻，结果的再现性——在这种情况下，冰的厚度和最小的污染——是一个主要因素。的徕卡EM GP.用一种独特的传感器解决由潮湿、弯曲的滤纸或弯曲的栅格引起的吸墨强度问题:该传感器检测滤纸和样本液滴之间的接触时刻，建立一个参考点。188金宝搏的网址将滤纸从这个参考点向前移动一定的距离，施加的压力从一个格子到另一个格子变化很小，如果使用相同的样品、体积和时间，就会产生高度可重复性的结果。
使用该印迹传感器，结果可以从施加到的4μl样品上的4μl样品非常有效地获得，其中允许在环境室中散布25秒，以99％湿度和30℃散布25秒°C。随后，将它们被印迹0.8秒并陷入液体乙烷中。从300kV冷冻中获得的这些冷冻和未染色的样本的显微照片挑选与类似直径相似直径的脂质体的颗粒。TEM（图1）。从这些选定的颗粒中，作者计算了在不存在细胞受体的情况下的病毒/膜组件的重建，模仿脂膜在icosaheSheyry的双重轴线上的紧密接触，示出了紧密病毒 - 膜复合物的结合机制（图2188金宝搏的网址）。
图2:三维重建，通过平均从显微图像中提取的275张单粒子图像计算，如图1所示。可以看到与膜的结合发生在二十面体对称的两重轴之一附近。脂质双分子层通过不对称3DR定位，产生分解较差的病毒粒子;为了帮助识别它的轴线，体量被对称和叠加(来自Mohit Kumar和Dieter Blaas, MFPL，维也纳/奥地利)。
Baculovirus actin彗星尾巴
维也纳分子生物技术研究所J.Victor Small实验室的Jan Mueller及其同事［2］使用冷冻电子断层扫描技术研究杆状病毒“彗星尾”中的肌动蛋白细胞骨架，这两种病毒体内也体外．这些肌动蛋白尾部被杆状病毒和其他病原体形成核，以驱动自身的推进力，这对传播感染至关重要。它们是研究肌动蛋白细胞骨架结构和调节蛋白作用的一个流行的和易于使用的模型系统。
为了体外用合成（易于操纵）“运动鸡尾酒”聚合的肌动蛋白尾部的实验，尾部不会在冻结之前移液到网格上，以防止通过操纵损坏。相反，它们在200目Au网格上直接在Quantifoil R3.5 / 1穿孔碳膜上。在用10nm蛋白涂覆的胶体金提供作为基准标记的用于对准的电子断层扫描的基准标记物，将其转移到潮湿的室中相对长度单位全科医生。将样品从背面吸干1.2至1.6 s，随后将其浸入略高于冷冻温度的液态乙烷中冷冻，并将其储存在液氮中，直到装入显微镜。为了减少背景，在300 kV条件下，使用SerialEM在多孔碳膜孔上方获取零损耗滤波倾斜序列，并使用IMOD离线重建（图3）。
对于该研究的另一部分，杆菌病毒肌动蛋白彗星尾巴被穆勒和同事在阴化细胞的薄涂层内部的薄橡胶和同事可视化，该壳体通过冷冻电子显微镜检测可访问。通过引入冷冻电子断层扫描和在三维中解析叠加结构的能力，大大提高了对该地区的调查［３］．
对于这些体内实验中，细胞被培养在200目金网格上，以消除铜离子的细胞毒性作用和电子断层扫描高倾斜栅格的阻碍。使用穿孔碳支持膜，如Quantifoil R1/4。一旦细胞附着和扩散，它们就被化学固定并提取以清除细胞质背景，从而能够可靠地跟踪单个丝状体。随后，用含有10 nm蛋白质饱和金颗粒的4µl培养基覆盖样品，并转移到环境室相对长度单位95%相对湿度下的GP。这些样品从徕卡上的印迹机制的设计中受益匪浅相对长度单位GP：由于单侧印迹，多余的液体仅呈栅格的背面，避免了敏感细胞单层和滤纸之间的直接接触。188金宝搏的网址预加湿的印迹时间为1.5至2.0s，使用C膜中的孔产生最佳结果，从而获得均匀的冰厚度。在印迹后，将样品立即灌注到液体乙烷中。如上所述获取和处理断层扫描数据（图4）。
图3：杆状病病毒肌动蛋白彗星尾巴的Cryo-Collecton术。a）在含有肌动蛋白，ARP2 / 3络合物，露珠蛋白，甲紫绿素和VASP的运动鸡尾酒中，在纯化的去置的杆状病毒中形成的彗星尾部的冷冻电子断层图（11nm）。插入从概述图像中的正方形显示分支连接的细节。b）源自断层照片的模型，显示肌动蛋白长丝在红色和分支结的红色。c）模型的特写镜头突出邻接病毒后部的丝绸。酒吧（a，b），100nm;c）25 nm;Inset，10 nm（Mueller J等）：电子断层扫描和杆状病毒肌动蛋白彗星尾部的仿真支持病原体推进的束缚灯丝模型。Plos Biol.12 [1]：E1001765，图A-C; DOI：10.1371 /杂志。PBIO.1001765.G005）。
图4：活体内杆状病毒肌动蛋白彗星尾的冷冻电子断层扫描。a） B16黑色素瘤细胞中杆状病毒彗星尾的冷冻电子断层摄影。图像显示了19纳米的断层图像。由于病毒尾巴不在冰层的一个平面上，断层照片显示在三张图像中，用白线分隔，在不同的z水平拍摄。插图显示了概览图像中方形的分支连接的详细信息。b） 从完整彗星尾模型后部投射，宿主细胞骨架的肌动蛋白丝（半透明）和一个微管（灰管）叠加在一起。Bar a），100nm（Mueller J等人：杆状病毒肌动蛋白彗星尾巴的电子断层扫描和模拟支持病原体推进的栓系丝模型。PLoS Biol.12[1]：图3a+d；doi:10.1371/journal.pbio.1001765.g003）。
药物纳米载波
浸入式冷冻和低温冷冻TEM不仅是结构和细胞生物学中不可缺少的工具，而且对药理学标本在其自然状态下的成像也非常有用(回顾，见［４］).一项由[5]用过的冷冻 -TEM浸没冷冻试样阐明不同超声工程纳米载体的超微结构，用于真皮药物递送：可视化固体脂质纳米颗粒，纳米结构脂质载体和纳米乳液。
这些实验的样品被冷冻在徕卡EM GP.，仪器的环境室在室温和95%相对湿度下运行。通过一系列预试验，获得了双蒸馏水中每个试样的最佳稀释度，以获得单个结构之间没有太多重叠的高密度试样。将4µl试样涂敷在辉光放电400目上相对长度单位网格涂有多孔碳膜。沉淀时间后，根据所用配方，将悬浮液吸干1.25–4.0 s。使用标准Whatman 1号滤纸和仪器的吸液传感器，吸液后立即将样品浸入液体乙烷中。
而来自cryo的尺寸信息-TEM与从动态光散射获得的数据互补，结构信息仅用于低温TEM并且在各个样本之间表现出相当显著的差异，从球形液滴到扁平的片状结构（图5）。请注意，由于快速处理和GP中集成的许多防污染措施，此处显示的显微照片中没有污染：这包括环境中的负压和主冷剂中的强大“TF”蒸发器，这会产生干燥和寒冷的空气2气体，保护标本免受热身和污染。
图5：纳米结构脂质载体（NLC），纳米乳液（NE）和固体脂质纳米颗粒（SLN）（SCHWARZ JC等，用于皮肤药物递送的纳米载体：制备方法，载体类型和流变性质。国际药学杂志437：83-88 [2012]，图2）。
推荐阅读
参考
- Kumar M，Blaas D：人鼻病毒亚病毒颗粒与ICosaheShry对称的双重轴线上的脂质膜结合。J.Virol。87：11309-12（2013）。
- MUELLER J等人：电子断层扫描和杆状病毒肌动蛋白彗星尾部的仿真支撑了病原体推进的系绳丝状模型。Plos Biol。12：E1001765（2014）。
- Medalia O等人：通过冷冻电子断层扫描显示真核细胞中的大分子结构。《科学》298:1209-13（2002）。
- Klang V, Valenta C，还有Matsko NB：药物系统的电子显微镜。微米44:45–74（2013年）．
- Schwarz JC等人：《用于皮肤给药的纳米载体：制备方法、载体类型和流变学性质的影响》。国际制药公司。437: 83–88 (2012).
