低温条件下用相关显微镜观察宿主细胞与细菌的相互作用

相关光镜及电子显微镜(CLEM)是一种成像技术，可使用光学显微镜对荧光标记或标记的结构进行识别和定位，随后使用电子显微镜进行近纳米分辨率的成像。CLEM是特别方便的可视化的罕见事件，不能追踪到电子显微镜本身。两种成像方式的结合是非常有吸引力的。在光学显微镜不能发挥作用的地方，电子显微镜就能帮上忙。电子显微镜的分辨能力比传统光学显微镜高出两个数量级，而且，电子显微镜提供了所需的参考空间，在那里可以直观地检查标记和未标记的结构。尽管使用CLEM在宿主-寄生虫研究今天不太常见，它满足所有标准，成为一种有价值的方法，以可视化和调查的感染过程，特别是在情况下，只需少量的寄生生物体引起疾病。

我们利用CLEM来研究包柔氏螺旋体burgdorferi还有一些哺乳动物的神经源细胞系。b . burgdorferi螺旋体细菌，是一种人畜共患的病原体，其感染周期交替在节肢动物载体的硬蜱种和脊椎动物宿主宿主之间。的传播b . b .i通过蜱叮咬导致与莱姆病相关的临床表现。我们的目的是研究……的趋势b . burgdorferi入侵非吞噬细胞，因为这方面的问题仍然不清楚。同时，我们想要找到一种快速和简单的程序，避免制备工件，这与在室温下样品制备的固有联系，例如那些由化学固定和脱水引起的［1］．为了做到这一点，我们雇用了新的Leica EM Cryo CLEM系统。利用该系统捕获的荧光图像与同样在低温下操作的扫描电子显微镜获得的图像相关联。在这些条件下成像确保了最好的可能的样品保存，非常接近自然状态。

为了检查和更全面地描述病原体进入宿主之前发生的事件，首先必须能够在宿主表面追踪病原体。为了在尽可能短的时间内达到这一点，光学显微镜是一种选择的方法。我们使用Leica EM Cryo CLEM设置，荧光显微镜与冷冻阶段，acryo-transfer航天飞机用液氮冷却可以很容易地转移冷冻样本，还有一个特殊的低温目标。

在玻璃化样品上使用荧光显微镜的重要前提是，在该物体玻璃化之前，必须将荧光标记物纳入感兴趣的物体。我们使用b . burgdorferi拿着一个绿色荧光蛋白记者，稳定表达［2］．神经细胞被植入到蓝宝石圆盘上(徕卡微系统)188金宝搏的网址b . burgdorferi螺旋体是后来加入的。在此之前，为了适应环境，TEM将探测网格(EMS)放置在蓝宝石圆盘上，圆盘上涂有碳涂层。它促进了感兴趣的细胞-病原体相互作用在电子显微镜下易于定位。

细胞通常生长得非常密集(图1A)，因此发现宿主细胞与细菌的相互作用将是相当困难的。为了避免这一困难，在蓝宝石盘上创建了查找网格(图1B)。在发现兴趣点的相互作用后，用低温荧光显微镜捕获图像(图1C)，低温扫描电子显微镜提供了更高的兴趣点分辨率，或参考空间(图1D)。

1. Dubochet J和Sartori Blanc N:没有聚集物的细胞。Micron 32: 91-99(2001)。
2. Dunham-Ems SM, Caimano MJ, Pal U, Wolgemuth CW, Eggers CH, Balic A，和Radolf JD:实时成像显示伯氏疏螺旋体在蜱中传播的两相模式。j .中国。投资。119(12):3652-65(2009)。