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在干草堆中找到针

筛选和分析

科学的目的是理解事物为什么会变化。这一点在生命科学中最为明显,因为变化是生物发展的动力。它们通常是由临时事件引起的,这些事件即使在一个大的个体群体中也非常罕见——因为与样本的寿命相比,事件发生的时间非常短。现代技术允许在很长一段时间内观察许多物体。如果一个人的假定事件被检测到,系统就可以聚焦到那个位置,并以高时间和空间分辨率记录数据。

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初级筛查:观察许多个体的发展

“初级筛选”的目的是找到和定位感兴趣的候选人或结构。这是在低分辨率和低光学切片性能下实现的,目的是尽可能少地改变样品。另一方面,主扫描必须以最大扫描速度执行,以避免在大量对象中错过一个短事件。通常,用于筛选的样品生长在多孔板中。这些聚合物嵌段包含许多空洞(这里称为“井”)。在每个井中通常有单个个体或少量细胞在生长。井板的网格结构允许容易的对象重新定位和变化监测。为了适应不同的样品尺寸,可提供6孔、24孔或96孔等孔板。例如,在不同发育阶段的斑马鱼胚胎是在多孔板上分析的典型对象(一个鱼胚胎被播种到一个孔中)。初级筛管的目的是在适当的时间分辨率获得每口井的充分信息。 This information is then used to recognize and decide which samples in which wells are of interest and should be investigated further in a so called Secondary Screen (see below).

通过观察大型视野来执行初级筛选。有时相机适合此任务。共焦可以提供更好的对比,现代系统提供低放大镜光学器件,用于一次性成像。大针孔设置的共聚焦成像是足够的(这也允许发现焦点事件)。双通道记录也有用,例如荧光图像和同时发射的光图像。主扫描所需的所有参数存储在“扫描作业”中,该参数可在分析罕见事件后继续进行筛选过程 - 或者第二天开始新实验。

在开始基质筛管实验之前,系统需要知道起始坐标和井在x和y方向上的距离。当井按规则的直角坐标模式对齐时,系统可以自动从井到井移动,或者按预定义的顺序移动,在操作员手动选择所有井后进行处理。不同的扫描作业可以在多个位置创建和自由组合。为了再现这些屏幕,xy坐标以及所有其他相关的成像扫描参数都可存储在模板中。在模板中存储参数的好处是显而易见的:如果你交换多孔板,只需要重新调整起始坐标。

这种自动化节省了大量的时间;可以在更短的时间内以标准化的方式进行更多的实验。

识别罕见事件

在主屏过程中,其中一个个体偶尔会开始修改其形状或其他光学特性(例如荧光强度、色比等)。一个典型的例子是从静止的核(g期)到分裂的核(有丝分裂)。图示:细胞核染色在形状和强度上有明显改变。

一种研究有丝分裂细节的可能性是通过观察监视器上的图像来检查所有的物体,并手动指示哪口井应该进一步进行更详细的研究。在许多情况下,这个程序已经是一个非常强大的工具来识别和跟踪罕见的事件。

如今,现代软件通常可以取代人类认可技能。目前,模式识别软件可用,可以自动识别各种复杂模式的球形,线条和巨大的工具箱等形态。来自主屏幕的图像在线传输到图像分析计算机,并行并行处理和评估,同时继续筛选过程。可以随时修改模式识别规则,以便适应实验变化或新的想法和研究目标。由于计算机是网络连接,因此规则集的监控和修改甚至可能从家庭办公室完成,包括远程控制显微镜。

从本质上讲,识别过程产生了多孔板中的坐标,标志着罕见的事件的位置。然后将该坐标转回系统。

以高精度记录和分析罕见事件

当发现感兴趣的事件时,任务是以详细信息录制和分析结构和时间变化。为此目的,系统必须驻留感兴趣的对象并执行预定义的数据采集计划;通常以高放大率和高分辨率。以发现包含罕见事件的井内的对象居中称为“单对象跟踪功能”。这是一个单独的作业,它识别井中的精确坐标并移动舞台以便为进一步的数据采集驻留这些坐标。这也很重要,因为物体在实验期间移动。它也可以以交互方式居中,然后通过单击单击激活高精度采集。对于其他任务,可以存储一系列识别的位置,然后自动记录。

高精度录制(“辅助屏幕”)在高倍率和高像素分辨率下完成。这里,光学变化系统(变焦)非常有用,因为它允许改变放大率而无需机械地改变物镜并且不容易被折叠。显微镜的所有参数都是自动调整的,倍率变化(例如针孔直径)。除了在X和Y中厘定,必须找到并识别对象的正确Z位置。为此目的,实现了自动对焦例程。

高精度扫描的其他参数可以在扫描作业中预存储。这些参数包括扫描速度、扫描格式、光谱特性、扫描方式、重复等。一个非常典型的高清晰度记录包括一个三维z-stack,允许分析结构变化和相互作用在罕见事件。

随着可以定义和组合不同的扫描作业的可能性,可以使用宏功能,其允许在单个位置执行复杂的实验。另外,可以将实验分配给各种位置并循环用于长期高清观察。

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