第六届欧洲超分辨率用户俱乐部会议摘要

Timo Zimmermann博士，基因组调控中心高级光学显微镜单元，Pablo Loza-Alvarez博士，西班牙巴塞罗那ICFO的超分辨率光学显微镜和纳米显微镜实验室

本次演讲简要介绍了主办本次会议的两个机构ICFO和CRG在超分辨率显微镜领域的过去和现在的活动。这两个研究所已经建立了一系列SR仪器，除了科学合作外，显微镜部门自2010年以来一直在超分辨率光纳米联盟(SLN@BCN)中合作。除了面向国内用户外，他们的目标是在欧洲和国家层面提供SR技术，并参与欧洲生物成像计划的各个方面。讲座将涵盖几种可用的SR工具的不同应用，以及在遵循快速发展的领域和相应地调整用户访问模型时所面临的挑战。

Alberto医生Lleó，西班牙巴塞罗那圣保罗医院神经内科

阵列断层扫描显微镜(ATM)是一种特别适用于突触研究的超分辨率技术。ATM通过将样品超薄切片成70 nm的条带，然后进行免疫荧光成像和感兴趣的结构的三维重建，克服了传统共聚焦的z分辨率限制。ATM允许以高通量半自动方式精确量化小结构的数量、体积和蛋白质标记。在我们的小组中，我们将ATM应用于人类脑组织的研究，以观察不同神经退行性疾病(如阿尔茨海默病(AD)和路易体痴呆)的突触变化。在阿尔茨海默病中，淀粉样斑块在大脑细胞外空间的积累是该疾病的主要特征之一。淀粉样斑块由淀粉样β (Aβ)肽聚集而成。目前尚不清楚Aβ聚集状态在体内普遍存在，尽管Aβ低聚物已表明对突触具有特别的毒性。然而，由于Aβ低聚物体积小，传统的成像技术并不适用。这里我们提出的组合发生的阵列断层扫描显微镜(ATM)对2例AD患者大脑中的Aβ低聚物进行成像。在与ICFO(巴塞罗那)的合作中，我们展示了低聚物组合可以在纳米级分辨率下与人脑中的成熟原纤维区分开来。

参考文献

1. Micheva KD，等。阵列断层扫描:一种成像神经回路分子结构和超微结构的新工具。神经科学。2007 7月5日;55(1):25-36．
2. Kay KR，等等。用阵列断层扫描和电子显微镜研究人脑突触。自然科学进展。2013;8(7):1366-80。
3. 皮克特EK，等人。突触内的非纤原性低聚淀粉样蛋白β。老年痴呆症杂志，2016年5月;53(3):787-800．

gravydas Lukinavicius博士，马克斯-普朗克生物物理化学研究所，纳米生物光子学系，Göttingen，德国

理想的荧光探针用于生物成像是明亮的，吸收长波长，荧光，可以灵活地实施在活细胞和体内。然而，结合所有这些特性的合成荧光团的设计已被证明是极其困难的。这一缺点是通过检查属于罗丹明类的几种候选物质来解决的，它们在黄蒽染料的第10位上有不同的替代品:四甲基罗丹明(氧)、碳吡啶(碳)和硅罗丹明(硅)。硅罗丹明(SiR)比普通的四甲基罗丹明或卡吡咯宁具有更好的产氟性能。原因是它们的螺化作用对微环境的介电常数天生敏感。因此，针对肌动蛋白、微管蛋白、DNA和溶酶体的SiR探针被开发出来，并成功地用于活细胞中这些结构的成像发生的和SIM显微镜。SiR和SIR700的组合，或SiR和carbopyronine的组合，可以实现多种细胞结构的多色成像和定位。此外，这表明SIRs是潜在有用的荧光团，用于生成针对细胞中不同结构的荧光探针。

参考文献

1. 近红外荧光团的活细胞超分辨率显微镜的细胞蛋白。化学进展，2013,29 (3):332 - 332．
2. 用于细胞骨架活细胞成像的荧光探针。自然科学进展，2014,27 (3):344 - 344．
3. SiR-Hoechst是一种用于活细胞纳米检查的远红色DNA染色剂。自然科学通报2015,1;6:8497．
4. 用于活细胞多色成像的荧光探针。《化学学报》，2016,138 (30)，pp 9365-9368．

在超分辨率显微镜和单分子检测中，每个分子的光子数量及其亮度最终决定了分辨率和信噪比。我们将从所使用的荧光探针的角度介绍超分辨率显微镜的发展，并讨论光稳定性[2]的作用。然后，我们将展示在超分辨率技术DNA PAINT中使用单个染料分子的全光子预算的最新进展[3-5]。DNA PAINT在与DNA纳米技术结合时尤其强大，并且已经产生了最高分辨率的DNA折纸纳米尺。这样的纳米尺已经成为展示分辨率的主要参考，并作为超分辨率显微镜[6]的阳性对照。我们还展示了金纳米颗粒旁边的成像如何被等离子体效应扭曲，产生单分子海市蜃楼。利用自组装DNA折纸结构，我们量化了等离子体的影响，也包括荧光染料的亮度增加[7,8]和光稳定性[9]。

参考文献

1. 见鬼，S.H.等人。2015超分辨率显微镜路线图。物理学报D:应用物理48,443001 (2015)．
2. 沃格尔桑，J.等人。让它们眨眼:超分辨率显微镜探针。化学工程11,2475-2490 (2010)．
3. Molle, J.等。瞬态结合的超分辨率显微镜。生物科技39,8-16 (2016)．
4. Raab, M.， Schmied, j.j.， Jusuk, I.， Forthmann, C. & Tinnefeld, P. DNA折纸的6 nm分辨率荧光显微镜。化学工程15,2431-2435 (2014)．
5. Jungmann, R.等人。DNA折纸瞬时结合的荧光成像单分子动力学和超分辨率显微镜。生物工程学报(自然科学版)
6. Schmied, J.J.等人。基于DNA折纸的定量荧光显微镜标准。Nat Protoc 9, 1367-1391 (2014)．
7. Puchkova, A.等人。DNA折纸纳米天线具有超过5000倍的荧光增强和25 muM单分子检测。Nano Lett 15, 8354-8359 (2015)．
8. Acuna, G.P.等。dna定向自组装纳米天线对接位点的荧光增强。科学学报，33,506 -510 (2012)．
9. 佩莱格罗蒂，J.V.等人。DNA折纸-金纳米颗粒杂化光漂白的受控还原。Nano Lett 14, 2831-2836 (2014)．

Hans-Georg博士Kräusslich教授，德国海德堡医院大学病毒学传染病系

人类免疫缺陷病毒颗粒在被感染细胞的质膜上组装，在那里，结构病毒Gag多蛋白、病毒包膜(Env)糖蛋白、病毒基因组和其他几种病毒和细胞因子聚集在一起，形成新生病毒粒子。从细胞释放后，最初未成熟的病毒粒子会成熟为传染性病毒。形态成熟是由病毒编码蛋白酶(PR)对结构多蛋白Gag和GagPol的裂解引发的。随后病毒粒子结构的完全重塑对HIV的传染性至关重要。这一成熟过程似乎受到高度调控，但目前缺乏动态信息。
我们使用各种超分辨率显微镜分析了HIV-1的组装位点和细胞外未成熟和成熟颗粒，并描述了病毒和细胞蛋白质的分布及其动态变化。我们使用Gag或GagPol内携带荧光标签的HIV-1衍生物发生的和4π风暴纳米技术可以可视化病毒粒子的亚结构，并原位研究HIV-1多蛋白加工的动力学。基于冷冻样品的电子断层扫描，获得的超分辨率图像证实了未成熟Gag壳的不完整性，揭示了未成熟病毒粒子中GagPol排列的新信息，并允许在未成熟和成熟粒子表型之间进行清晰的视觉区分。利用最近描述的一种耐光性PR抑制剂，我们能够在纳米级观察下在纯化的HIV-1颗粒中触发Gag过程，并随着时间的推移跟踪成熟过程。这种方法使我们能够确定HIV-1 Gag原位加工的半衰期约为30分钟。这项工作为未来研究HIV-1在宿主细胞膜新生病毒粒子中的成熟提供了基础。

Steffen Dietzel博士，生物医学中心188bet怎么注册(BMC)， Ludwig-Maximilians-Universität München (LMU)和Walter-Brendel-Zentrum für Experimentelle Medizin, LMU，慕尼黑，德国

受激辐射耗竭(发生的)显微镜是应用比较广泛的超分辨率技术之一。它结合了打破衍射障碍的优势，相对快速的图像生成和相对易于在商业系统中使用。在我们的研究环境中，许多小组都对染色质的结构感兴趣。不幸的是，当我们开始这项研究时，没有DNA特异性染料被描述为能很好地工作发生的在哺乳动物细胞中。因此，我们研究了一些DNA染料和标签的适用性。一个好的发生的染料是明亮的，可以有效地消耗发生的激光。重要的是，染料不应该被耗尽激光激发。
在预选了主要染色细胞核(较少染色细胞质和RNA)的核酸染色剂后，选择了5种dna结合荧光染料进行进一步研究，分别是DAPI、Hoechst、SYTO 16、SYTO 21和SIR-DNA。除此之外，我们还研究了用EdU标记DNA复制，并用Alexa 488、555和594进行检测。在足够长的孵育时间后，分裂细胞的完整染色质将被这种技术标记。Alexa 594以前被描述为一种很好的氟色素发生的因此希望能提供一个阳性对照。

用我们的徕卡SP8发生的3X，每个标签首先在共聚焦模式下成像，然后用消耗激光的增加功率成像。如果可能的话，分别使用592、660和775 nm的耗尽染料。此外，还测量了每种染料在各自耗尽激光下的反斯托克斯激发强度。由于损耗PSF的大小很大，如果存在反斯托克斯激发，则有可能大大降低所实现的分辨率。对于增加损耗激光强度，我们的数据表明，许多染料都有一个甜蜜点，在那里损耗已经相对较高，但反斯托克斯激发仍然很低。如果在合适的浓度下进行标记，EdU-Alexa 594标签确实获得了良好的耗尽和低抗stokes激发的最佳结果。此外，相对较低的漂白也可以用超分辨率对整个核进行3D记录。更详细的结果将在会议上公布。

Valeria Caiolfa博士，马德里CNIC显微镜和动态成像部门

我们参与了一个合作项目，探索作为细胞生长信号平台的细胞膜结构域。通过共聚焦成像，这些结构域显示为几种信号分子(包括Trops、四胱甘肽和gf受体)的清晰合并区域。他们测量几十微米，动态循环，随着时间的推移具有意想不到的稳定性。我们正在探索TROP和四跨蛋白分子结构域内外的组织和异质性发生的超分辨率显微镜。(与意大利基耶蒂大学Saverio Alberti合作)

Lorenzo Albertazzi博士，加泰罗尼亚生物工程研究所(IBEC)，西班牙巴塞罗那

基于单分子定位的超分辨率成像技术，如风暴，棕榈由于其纳米级分辨率、3D和多色能力，GSD、PAINT和许多其他变体显示出巨大的潜力。由于单个染料分子的密度和光化学控制是这些技术的关键，因此方法的化学方面对于实现高质量成像至关重要也就不足为奇了。在这次演讲中，我提出了关于超分辨率显微镜的化学观点，讨论了诸如标记策略、染料的选择、光转换机制和缓冲液制备以及如何选择和优化它们以获得最佳性能等问题。重点介绍染料合成、标记程序和缓冲液制备方面的最新进展。超分辨率成像在材料化学等领域的新应用将被展示，证明超分辨率的潜力超过了在细胞和分子生物学中的应用。特别是小说的发展风暴和PAINT方法在体外研究仿生材料的结构和动力学及其与细胞的相互作用。