用立体显微镜更有效地研究发育生物学:果蝇(Drosophila Melanogaster)

黑腹果蝇100多年来一直是遗传研究的模式生物，今天仍被广泛用于遗传学、生理学、发病机制和进化领域的发育生物学研究[1,2]。大量护理相对容易且不贵。它繁殖快，产卵多，生命周期短，只有2周[1,2]。果蝇只有4对染色体[3]，其中许多染色体都很大，因此很容易定位[4]突变和[5]缺失。它的整个基因组[6]已经测序，许多突变可供使用。在两个基因组中发现的癌症和疾病相关基因的同源性d .腹而人类是重要的[7,8]。

在对果蝇进行日常工作时，通常有几个常见的步骤d .腹：

1. “推蝇”，即通过立体显微镜观察可见标记物对苍蝇进行基本分类，通常每天进行;
2. 荧光筛选，类似于苍蝇推，但通常涉及观察胚胎或幼虫荧光立体显微镜分离成功转染，基因表达从那些不表达;
3. 通过立体显微镜进行解剖;
4. 记录或成像，通常用共聚焦或复合显微镜完成，但高性能立体显微镜也是可能的。

为了清晰起见，在本文中，上述果蝇日常工作的步骤序列将被称为“工作流”(参见图1)。在许多情况下，工作流并不是工作步骤的线性“流”。

在尝试开发更有效的工作流程时，必须考虑以下几点:

• 确定特定研究的关键任务，例如，使用可见标记或荧光蛋白标记对果蝇进行筛选育种;
• 每一步所花费的时间和总步骤数:通常工作流程是每天重复的，繁琐的，耗时的工作，必须可靠和准确地完成，以保持所需的果蝇谱系;
• 普通立体显微镜:更好的效率，良好的照明，分辨率，和人体工程学的方法;
• 标本特征:一般来说，苍蝇和其他昆虫主要由多糖几丁质和各种蛋白质分子组成，它们可以促进自身荧光(来自标本的不需要的背景荧光信号)[9]，并降低信噪比
  (S/N)比;
• 荧光立体显微镜:更快的工作流程，快速切换过滤器，荧光和亮场，以及快速放大和缩小;
• 解剖:灵活的照明和显微镜架选项提供符合人体工程学的工作流程;而且
• 记录/成像:记录突变表型，拍摄行为变化，测量解剖特征，如翅膀或腿的大小，以及细胞迁移的时间推移成像(通常用共聚焦显微镜完成)。用立体显微镜进行记录通常需要不同的数码彩色相机设置。

飞推

推蝇是指每天根据解剖特征和表型[10]对果蝇进行分类。苍蝇一般用一氧化碳麻醉₂并申请了CO₂用于分类的灌注垫。通常，分选是用立体显微镜完成的。

有几种类型的立体显微镜可从徕卡微系统，通常可以用于果蝇188金宝搏的网址d .腹苍蝇推，特别是徕卡M50，徕卡M60，和徕卡M80CMO(通用主物镜)立体显微镜[11]。

这些显微镜提供的一些优点:

• 具有极高透光性的光学器件，使许多细节一眼就能看到，而不需要使用可能产生阴影或亮点的额外明亮照明;

• 视场数(FN)为23毫米的目镜，可以提供更大的视场(FOV)/物体场(of)，让用户快速概述苍蝇在垫的大面积快速，高效地推动苍蝇(注意:徕卡M80的视场比徕卡M50和徕卡M60更小-参见图2);

• 徕卡M80实现了更好的分辨率(最大数值孔径[NA] 0.206)比徕卡M60和徕卡M50(最大NA为0.15)-更高的分辨率有利于细微表型的识别，如鬃毛形态;
• 对于徕卡M50和徕卡M60的较宽视场，根据应用情况，通常建议使用平面消色差物镜，而徕卡M80使用消色差物镜就足够了[12,13];
• 徕卡M50、徕卡M60和徕卡M80可以配备徕卡LED2000或徕卡LED2500多功能显微镜架和照明系统，使桌面工作空间没有电缆和外部光源(注意:通常果蝇被养在数百个塑料小瓶中，这些塑料小瓶填满了工作空间，偶尔设备上的电缆会被用户撞到，不小心把一些小瓶撞到地上);
• 适用于立体显微镜的人体工学配件，如徕卡ergowedge，缓解了重复性工作的压力(注意:当显微镜使用者在实验室里感觉更舒服时，整天都在飞推，他们会更有效率，人体工学配件可以经济地改装到旧型号的徕卡显微镜);
• 紧凑型LED光源安装在支架上，可以方便地移动显微镜进行清洁，并为用户提供更多的自由工作台空间。

下面的照片展示了一个典型的果蝇实验室用立体显微镜观察苍蝇(由奥地利维也纳大学神经生物学系T. Hummel提供)。

显微镜底座尺寸

显微镜足迹是每个实验室的一个关键考虑因素。一氧化碳飞行垫₂麻醉药有不同的尺寸，但都倾向于在苍蝇推显微镜底座时脱落，因为底座可能太小。

解决这个潜在问题的方法是:

• 使用中等尺寸的底座;或
• 或者也可以使用小型摇臂(臂)支架，直接在工作台上工作(参见图5)徕卡LED3000带有鹅颈的聚光灯照明(SLI)可以直接安装在摇臂架上，所有的照明控制都可以直接安装在鹅颈上，所以它们不会拥挤在长凳上。

格里诺优点:

• 通常工作距离比CMO立体显微镜长;而且
• 一个经济的解决方案。

格里诺缺点:

• 有限的模块化;而且
• 镜片系统的光轴(每只眼睛)会聚到标本放置的中心点。每只眼睛的两个独立焦平面不允许在远离中心的标本上对两只眼睛进行清晰的聚焦(参见图6)。

CMO优点:

所有标本都位于双眼的同一焦平面上，与格里诺立体显微镜相比，在特定放大倍率下的可用视场更大[14,15]，并允许:

• 更大的概述，更少的需要重新聚焦和移动飞行垫;
• 更快地识别果蝇;而且
• 更流畅的工作流程，让飞推不那么繁琐。

图6比较光学格里诺和CMO立体显微镜。

在许多实验室中，经过基因型[16]修饰的果蝇的特殊品系表达诸如Green (绿色荧光蛋白)、红色(RFP)、青色(CFP)和黄色(YFP)荧光蛋白被使用[17,18]。通常，用荧光立体显微镜观察和分析苍蝇幼虫或胚胎，然后根据荧光标记的存在或不存在选择，希望在预期的器官中。用荧光蛋白标记，比如绿色荧光蛋白，使得从突变幼虫中筛选非突变幼虫的工作变得容易得多。然而，为了收集足够的数据进行分析，必须对许多果蝇幼虫进行筛选和分析。

有几种类型的立体显微镜可从徕卡微系统，可用于荧光筛选果蝇188金宝搏的网址徕卡M165 FC徕卡M205 FA和徕卡MZ10 F(参见图7中的示例图像)。

每台显微镜的优点如下:

徕卡M165 FC, M205 FA，或MZ10 F荧光立体显微镜提供苍蝇筛选:

• 最佳的信噪比(S/N)荧光显微镜由于独特的三束设计;
• 徕卡M205 FA具有最好的分辨率(最大NA为0.349)，其次是徕卡M165 FC(最大NA为0.3)，然后是徕卡MZ10 F(最大NA为0.25);
• 徕卡M165 FC和徕卡M205 FA使用计划消色差物镜，而徕卡MZ10 F是典型的消色差物镜;
• 徕卡M165 FC和徕卡M205 FA已编码光学可靠的测量苍蝇解剖结构，例如，尺寸和表面积的腿，翅膀，眼睛等;
• 徕卡M205 FA具有FusionOptics技术[19]视觉3D感知通过目镜与最高分辨率和景深，同时，甚至在高放大倍率，这是非常实用的荧光筛选;
• 徕卡M205 FA是全自动荧光立体显微镜，因此，也可以用于复杂成像，如z-堆叠和多通道采集;而且
• 人体工学配件，如徕卡ErgoTubes，通过允许目镜的高度和角度根据个人用户的舒适度进行调整，缓解了重复性工作的压力，从而提高了工作效率。

对果蝇及其幼虫进行解剖是为了对器官和组织进行更详细的研究。一般采用高性能立体显微镜进行解剖。

对于果蝇和幼虫的解剖，徕卡M80立体显微镜通常是足够的，但徕卡M125具有更高的放大倍率和分辨率以及良好的视场，这使得它更适用于果蝇器官的制备，例如大脑(参见图8中的示例)。通常情况下，稍后使用更高分辨率的共聚焦、复合或立体显微镜对器官进行成像。

果蝇的眼睛、腿、身体和翅膀突变的表型特征通常使用编码立体显微镜进行记录，通常是更高性能的系统，如徕卡M205 FA、徕卡M165 FC、徕卡M205 a、徕卡M205 C、徕卡M165 FC、徕卡或M165 C徕卡DMS1000或徕卡DMS300可能很有用，允许在相对较小的设置上捕获高帧率和大概览。此外，徕卡应用程序套件X (拉斯维加斯X)软件提供了诸如扩展景深(EDOF)或图像z-堆叠等功能，用于快速、常规的3D苍蝇特征描述。使用编码莱卡立体显微镜与拉斯维加斯X软件，所有的图像将被正确校准，从而保证准确测量翅膀大小，腿长，眼表面，以及其他相关的表型变化。

对于许多研究，果蝇表型的表征必须在亚细胞水平[21]进行。记录解剖果蝇部分以获得亚细胞水平的细节通常是用共聚焦或复合显微镜完成的，如显微镜徕卡TCS SP8或徕卡TCS SPE(共焦)或徕卡一张路易十六时期的(化合物)。

徕卡M205 FA完全编码和自动化，使复杂的成像任务更容易完成。编码和自动化在细胞和亚细胞水平提供可靠的测量。徕卡M205 FA采用FusionOptics技术[19]和符合人体工程学的配件。

果蝇，果蝇,一个多世纪以来一直是发育生物学研究的模式生物[1,2]。它的基因组已完全测序，与疾病相关的基因显示出与人类[7]的明显同源性。

果蝇的日常工作流程d .腹，涉及立体显微镜的多个步骤:

• 推蝇，每日基本分拣蝇类;
• 荧光筛选，观察胚胎或幼虫;而且
• 为以后的记录或成像进行解剖。

果蝇的解剖结构或整个器官的记录或成像通常用立体显微镜完成，用共聚焦或复合显微镜解剖部分以获得亚细胞细节。

该报告引用了科学家和技术人员研究果蝇的例子，例如d .腹并展示了不同的可能设置与大范围的显微镜和配件。由于每个实验室的需求可能有很大差异，因此可以使用大量的配置和仪器来解决工作流程中的特定任务，甚至可以使用一台仪器执行更多的工作步骤。这份简短的报告根据不同成熟的果蝇实验室的经验提出了建议的工作流程，在建立或扩大果蝇实验室时可以作为非常有用的参考或指南。

我们要感谢奥地利维也纳大学神经生物学系的Laura Geid和Thomas Hummel教授提供的果蝇实验室照片，以及新加坡IMB, A*STAR, Bruno Reversade教授。

1. Manning G:简单介绍一下黑腹果蝇。果蝇虚拟图书馆。
2. 1933年诺贝尔生理学或医学奖得主。诺贝尔基金会，瑞典斯德哥尔摩。
3. 染色体。国家人类基因组研究所(NHGRI)，美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院(NIH)。
4. 突变-谈论遗传学术语。国家人类基因组研究所(NHGRI)，美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院(NIH)。
5. 缺失-谈论遗传术语。国家人类基因组研究所(NHGRI)，美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院(NIH)。
6. 基因组-遗传学术语汇编。国家人类基因组研究所(NHGRI)，美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院(NIH)。
7. Reiter LT, Potocki L, Chien S, Gribskov M，和Bier E:黑腹果蝇人类疾病相关基因序列的系统分析。Genome Res. 11 (6): 1114-25 (2001);doi: 10.1101 / gr.169101。
8. Herrero J:如何获得两个物种之间的所有同源基因。英国剑桥乐团项目。
9. 霍夫F:如何为免疫荧光显微镜准备你的标本。科学实验室。
10. 表现型-遗传学术语词汇。国家人类基因组研究所(NHGRI)，美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院(NIH)。
11. 立体显微镜的历史-第三部分:19世纪-现代显微镜制造的突破。科学实验室。
12. 立体显微镜的历史-第二部分:18世纪-对光学的更高要求。科学实验室。
13. 目标类。188金宝搏的网址徕卡的微系统。
14. Rottermann R，和Bauer P:如何形成清晰的图像:景深在显微镜。科学实验室。
15. 镜胶D:选择立体显微镜时应考虑的因素。科学实验室。
16. 基因型-遗传学术语词汇。国家人类基因组研究所(NHGRI)，美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院(NIH)。
17. Greb C:荧光蛋白-介绍和光光谱特性。科学实验室。
18. 赋予SA:在果蝇中检测基因表达-应用笔记。徕卡生物系统。
19. Goeggel D, Schué A，和Kiper D: FusionOptics -结合高分辨率和景深的理想3D光学图像，科学实验室。
20. Maimon I，和Gilboa L:果蝇幼虫卵巢的解剖和染色。Jove, doi: 10.3791/2537。
21. De Bock J:马赛克图像:将属于一起的东西聚集在一起。科学实验室。