定量一步方案以检测激光微量样本中的转录物

在过去的几年里，中国植物保护研究所(UOS Torino)和生命科学与系统生物系(Torino University)的研究小组在激光显微解剖(Laser MicroDissection，简称Laser MicroDissection)的应用上取得了良好的经验。LMD）对AM共生的基因表达研究。在细胞内殖民化期间，两个合作伙伴都经历了显着的修饰，导致互惠有益效果。在该过程中的所有细胞反应被基因表达的重要变化镜像，全局转录组分析揭示了在菌根根中激活的基因（在Küster等，2007中审查）。

然而，整个根表达谱由于交互中涉及的多种细胞类型的存在而变得复杂。事实上，在一个完全分化的菌根中，存在着各种类型的细胞。这些细胞包括定殖的表皮细胞和皮质细胞以及其中的非定殖细胞。丛枝被认为是共生关系的关键结构，在第一次出现后，共生关系的所有发育阶段都出现在根系中。这是由于在一个充分发展的共生关系中，在根皮层的初始定植后，继发感染事件开始，并再次定植。每种细胞类型很可能在相互作用中扮演一种或多种不同的角色(Balestrini et al.， 2009)。因此，在分子水平上对这一过程的检查存在缺陷，即共生关系的发展不是一个同步的过程。使用包含不同细胞类型和丛枝发育阶段的整个器官，实际上可以掩盖细胞类型在RNA或蛋白质水平上的特异性差异。

为了克服这个问题，LMD在过去的几年中，已经被用于研究丛枝菌根的细胞特异性，特别是关注包含共生的主要特征的皮层细胞:丛枝。Balestrini等人在2007年的开创性工作中开发了一种从菌根的石蜡切片中获取含有丛枝菌的细胞的方法LMD利用一步RT-PCR方法鉴定番茄AM根中丛枝菌特异性的磷酸盐转运基因(Balestrini et al.， 2007)。

后来，一种类似的方法被用于追踪含有丛枝菌的细胞中有限数量的基因，使用的是来自同质细胞群的RNA (Fiorilli等，2009;Gomez-Ariza等人，2009;Gomez等人，2009;Guether等，2009a;Guether等，2009b;Guether等人，2011)，证实了这一点LMD可以被认为是一个强有力的工具，以鉴定基因涉及在一个特定的殖民阶段。有趣的是，这种方法不仅被应用于验证共生阶段植物基因的表达，也被应用于真菌基因的表达(Perez-Tienda et al.， 2011;Tisserant等人，2012)。

最近，Hogekamp等人(2011)将基于整个菌根的全基因组转录组分析与基于激光显微切割获得的特征细胞类型的实时RT-PCR实验相结合。同年，LMD还结合高通量转录组分析，研究AM发育过程中根系细胞类型特异性转录组重编程(Gaude et al.， 2011)。

Medicago Truncatula.腐烂的根源莲花japonicus.采用三明治法获得的菌根和非菌根，切成约5mm的片，放入含有新鲜配制的Farmer 's固定液(无水乙醇/冰醋酸，3:1,v/v)的无rnase管中。在室温下真空处理20 min后，更换固定液，根样品在4℃下孵育过夜。

随后，根在一系列乙醇(50%，70%，90%，100%两次)中脱水，然后放入Neoclear(默克)，每一步冰敷30分钟，Neoclear逐渐被石蜡取代(Paraplast Plus;σ)。将约10-20个Paraplast Plus芯片加入20 ml新鲜neocl中，室温保存2 h，然后在58℃下保存3 h。一旦芯片在58°C下溶解，混合物在58°C下被熔融的准质体Plus取代。第一步O.N后，在纯石蜡包埋前大约4-5小时更换两次石蜡。根标本石蜡包埋在培养皿中，4°C保存。

一个徕卡LMD如Balestrini等人(2007)所述，该系统用于从石蜡根切片中收集丛枝定植的皮层细胞。为了追踪真菌基因的表达，2500个含ARB细胞(ARB)来自m . truncatula用显微解剖方法对根进行解剖LMD细胞为每两个生物复制;RNA提取遵循Pico Pure试剂盒(Arcturus Engineering)协议。根据制造商的说明(10ml DNAse I + 30ml RDD buffer for 20 min)，使用Pico Pure色谱柱中无rna DNAse Set (Qiagen)进行DNAse处理。

相比之下，遵循我们孤立的不同细胞型种群的植物基因的表达莲花三种不同的群体的细胞（arb，含有仲裁的皮质细胞; Mnm，来自菌根根的非菌根皮质细胞; C，来自非菌根根部的皮质细胞），并在用微微纯净的RNA提取后，RNAsubjected to a DNase treatment using a RNase-free DNase (Promega Corp., Madison, WI, U.S.A.; Balestrini et al., 2007). In both the experiments, we used non-amplified RNA samples for qRT-PCR of selected gene candidates.

从所考虑的细胞型群中分离RNA样品，并使用特定的生物rad试剂盒直接用于实时RT-PCR。我们决定使用未扩增的RNA以避免在RNA扩增期间的技术伪影。用Icycler设备（Bio-rad）进行的定量RT-PCR扩增反应在25μL的总体积为25μL，含有2μLRNA，12.5μL2XSYBR绿色RT-PCR反应混合物，每个引物的0.5μl（10μm）和0.5μl的IScript逆转录转发酶，用于一步RT-PCR（Bio-rad）。使用以下PCR程序：50℃，10分钟，95℃5分钟，50个循环为95℃，10秒，60℃，30秒。

为了排除引物产生非特异性PCR产物的情况(Ririe et al.， 1997)，在每次运行结束时都记录了一条熔化曲线(80步，升温速率为0.5℃/ 10秒，并进行连续荧光测量)。使用针对真菌和植物基因的特异性引物成功进行扩增反应。基线范围和CT值使用ICYCLER软件自动计算。转录物水平被标准化为真菌或植物内政基因的CT值（Fiorilli等，提交; Giovannetti等，2012）。

所有反应均在至少两个生物重复和两个技术重复上进行，重复之间具有良好的相关性。当我们使用真菌引物时，来自同时包含真菌和植物RNA (ARB细胞)的细胞型群体的RNA必须是纯的，而可以为植物基因稀释，这表明真菌RNA所占的比例低于植物RNA。

使用基于QPCR的定量分析使我们能够计算含仲卷的细胞中的真菌和植物转录物的百分比，确认这一假设（Fiorilli等，提交）。我们在这项工作中使用了几种真菌和植物基因，确认了方法的强度。用该方法获得的结果的有效性主要是通过在定量之前未扩增RNA的事实，并且在每种细胞类型中保留了RNA的确切量。

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