研究的焦点
我们的目的是在单细胞水平上研究为什么有些细胞类型比其他细胞更容易患像帕金森病这样的神经退行性疾病。通过激光显微解剖从人死后脑组织中提取这些细胞后，我们对其进行分子生物学检查。特别是，我们正在寻找线粒体DNA (mtDNA)的损伤。虽然有越来越多的证据表明，线粒体可能在神经退行性疾病和衰老过程中发挥重要作用，但迄今为止，单细胞分析尚未对线粒体进行彻底的研究。
线粒体老化假说
线粒体是非常特殊的细胞器，它们有自己的遗传物质mtDNA。它们通过呼吸链为细胞产生能量，自由基作为细胞呼吸的废物被释放。这些氧化的氧化合物然后破坏邻近的线粒体dna。现在人们认为，在一个人的一生中，线粒体dna损伤会不断累积，一旦达到一定的阈值，就会损害细胞并最终导致细胞凋亡。大脑受到的影响尤其严重，因为脑细胞在很大程度上没有被替换。因此，人们认为神经退行性疾病的原因之一是某些类型的细胞加速死亡。在帕金森氏症的病例中，这些主要是黑质(中脑的核心复合体)产生多巴胺的细胞。
图1:线粒体老化与神经退行性变理论的分子恶性循环。即使在正常条件下，活性氧(ROS)也会在呼吸链中形成。这种氧化应激损害邻近的线粒体dna，从而也损害线粒体蛋白。渐渐地，呼吸链的功能被扰乱，导致更高的ROS产生。其结果是ATP的产生减少，最终导致细胞功能紊乱和细胞凋亡。
与大脑样本一起工作
与人类大脑样本一起工作不仅需要特殊的挑战，也有限制。这不仅是因为人类死后的脑组织只能通过特殊的脑库获得，而且数量非常少。我们的部分工作涉及到基于RNA的基因表达分析，这在很大程度上取决于组织的质量——从病人死亡、器官摘除到标本冷冻和充分冷却之间的时间。解冻后仅几个小时，RNA就会被酶降解。如果这发生在实验之前，基因表达的结果是无用的。
当先前同意为研究目的采集组织样本的合适患者死亡时，将立即通知相关的国家脑库。尸体被尽快运到一个病理机构，大脑按照标准化的程序被移除。至少有一半的大脑瞬间被震霜，在零下80摄氏度的温度下，它的质量可以保持多年。在实验中，材料被加热到-20°C。然后制作20微米厚度的冷冻切片，并安装在特殊的标本载玻片上用于激光显微切割。然后，在解剖所需的细胞并处理它们进行基因表达之前，将它们立即染色。
结果
在我们的一项研究中，我们比较了帕金森患者的死后脑切片和相同年龄的健康对照组样本。通过对样本进行染色，我们可以看到黑质中有很多细胞线粒体功能紊乱。用激光显微解剖法提取这些细胞，观察其呼吸链和线粒体dna。检测结果显示mtDNA有很高比例的突变(缺失)。
然后，我们比较了帕金森组和对照组的大量细胞，发现帕金森组的缺失数量显著增加——实际上比过去认为的要多得多。20年来它一直知道有mtDNA的变化,但是我们总是认为这是百分之几的问题。用单细胞技术我们可以证明50 - 60%的mtDNA帕金森患者受损,导致激烈的能源赤字影响细胞。
我们惊讶的是，60至70岁的控制患者有很多突变，但虽然比帕金森集团明显少得多。在第二步中，我们从几个月到一百岁时检查了所有年龄段的人的控制样本。我们发现MTDNA删除随着年龄的增长而增加。我们出生在Noor极少的删除，在我们的某些阶段，达到50％至60％的突变突出阈值。
图2:(A)黑质多巴胺能神经元细胞色素c氧化酶(COX)和琥珀酸脱氢酶(SDH)染色。正常神经元是cox阳性(棕色)。高水平mtDNA缺失的神经元是cox阴性(蓝色)。(B)用激光捕获显微切割术切除cox阴性神经元(中间图)，并在PCR管的盖子上识别(右边图)。(C)实时PCR定量cox阳性和cox阴性神经元的mtDNA缺失。cox阴性神经元有较高水平的mtDNA缺失。(D)神经元个体的长链PCR显示mtDNA克隆扩增缺失(条带短于右侧mtDNA野生型条带)。(E)对对照组多巴胺能神经元mtDNA缺失量的分析显示，随着年龄的增长，缺失量稳步增加。
激光微粉的作用
激光显微解剖在我的工作中扮演着极其重要的角色，因为对单个细胞的精确解剖可以确保我们真正检查我们感兴趣的细胞。在激光显微解剖出现之前，大多数检查都是在匀浆上进行的。这些细胞包含不同类型的细胞，所以我们正在研究的分子连接有时会在巨大的背景噪音中消失。如果一种疾病只影响一种特定的细胞类型，如帕金森氏症，我们只有在能够分析同质细胞材料时才能获得有意义的结果。这就是激光显微解剖的优点。
线粒体损伤疗法——一个治愈衰老的可行机会?
当然，这种疗法在原则上是可行的。一种方法是使用抗氧化物质来防止细胞积累线粒体损伤。另一方面，关于如何使已经受损的细胞产生更多健康的线粒体的广泛研究正在进行。然而，现在预测结果是否以及何时将在医院日常工作中假定与线粒体疾病相关还为时过早。
线粒体功能紊乱当然不是衰老的唯一原因。最近的一篇评论比较了关于我们为什么变老的一百多个假设。即使我们设法保护了线粒体，认为细胞会过上健康长寿的生活的结论也是错误的。这可能会引发新的问题。将线粒体保存为不老泉的配方;这太简单了，当然，这是我们工作的一个很好的方面。
