显微化学分析用激光显微切割植物细胞和组织材料的制备

采用Leica LMD6000和Leica LMD7000激光显微解剖系统，对不同植物的特定细胞、细胞群和显微组织块进行解剖扩张器种（血吸虫科）［1］，挪威云杉(挪威云杉,松科）(2、3),金丝桃属植物种（金丝桃科）[4]，油菜籽（甘蓝型油菜十字花科,L。)[5],Colquhounia coccineavar。蒙西斯（唇形科）［6］和大麻（美人蕉科）［7］．通用工作流LMD.程序，样品的制备LMD.(A.)激光显微切割(B)术后标本处理(C)并对目标植物次生代谢产物进行了分析(D)。相同或类似的方法仅详细描述一次［8］．

LMD是一种从黄叶中提取分泌腔的工具Dilatris pillansii巴克，Dilatris corymbosa伯格，还有粘滞扩张肌l

分泌腔从新鲜扩张器组织

血藤科、山茱萸科、山茱萸科和芭蕉科的植物科有一组共同的次级代谢产物，称为苯基苯醌[9]．属扩张器是血桃科中唯一已知具有内部分泌腔(SC)的成员，其红色表明存在苯基phenalenones。使用研磨的方法提取表面SC从盾状腺毛的一些成员的唇形科已经成功［10］；然而，外科解剖内部SC准确地将SC与周围组织分离，从而允许其内容物的植物化学分析提出了一个新的挑战［1］．

(A.）在第一种方法中，新鲜的叶子D。pillansii被切成小块，然后嵌入组织冷冻介质，在液氮中迅速冷冻。在石蜡包埋过程中，有机溶剂被用来化学脱水植物组织，这可能会造成损害LMD.样品和导致SC的橙色内容物完全丧失，冷冻固定（在-25ºC下）被认为更适合于制备组织样品以供进一步研究LMD.．用切片机将冰冻的叶片切片，并放置在载玻片上。

(B)60µm的厚度被证明是分离SC腺上皮细胞及其分泌储存空间的最佳方法。这通常是在一次激光运转中实现的。仅在少数情况下观察到泄漏，因此丢弃了这些SC。SC中植物化学成分的高粘度将后者固定在玻片上。因此，在立体显微镜下，使用锋利的解剖针从玻片上取出25个分离的SC。

(C)切除后的样本处理包括用丙酮:水(20:1)的混合物提取次级代谢物，并用离心机清除细胞碎片。上清液直接转移到新鲜微管中，在氮气下干燥。

(D)残渣在氘化溶剂中重新溶解，用反相高效液相色谱和低温分析^1.核磁共振（NMR）波谱。两个主要和一个次要的苯基苯醌被确定比较^1.化合物的H-NMR谱和HPLC色谱图LMD.与对照化合物的样品。通过选择的积分比确定检测到的苯基苯烯酮的相对比例^1.核磁共振信号。糖苷苯基苯烯酮的缺失提示SC是亲脂的隔室。

分泌腔Dilatris Herbenulium.组织

本文建立了一种解剖180年生植物标本室标本叶片及内外花被片的新方法d .人造丝和d . corymbosa样本）。与新鲜叶片材料中的SC相反D。pillansii，植物标料材料的SC没有通过各个边周围的异质细胞覆盖［1］．

(A.)特殊制造的金属框架与薄玻片相结合，可以将SC固定在整个样品中。

(B) 20个SC收获使用LMD.．

(C利用重力将微解剖的材料收集在微管的盖子中，然后直接转移到核磁共振管中，无需离心。

(D)加入氘化溶剂，超声1 min，低温测定提取的植物代谢物^1.核磁共振波谱。一个苯基苯醌通过比较^1.H-NMR波谱与真实参考物的波谱一致。在新鲜植物材料和超过180年的植物标本的SC中检测到一种苯基苯醌，证明了这种次生植物代谢物的长期稳定性。

LMD作为探索挪威云杉植物化学成分的工具(挪威云杉)树皮

石细胞

挪威云杉(挪威云杉)是欧亚北美洲北方和温带森林中最丰富的针叶树种类。这种生态和经济重要的针叶树合成了大黄品等化学防御化合物，单级，酪蛋白和二萜类化合物的粘性混合物，以及多样化的酚类，包括苯丙烷醇，斯蒂芬和黄酮类化合物，作为参与病原体和草食动物的次生植物代谢物．许多出版物已经处理了大黄树脂的防御作用，而较少的是解决了多酚的作用，这是Schiebe等人的调查的重点。[11]．的组合LMD.低温NMR光谱对挪威云杉树皮中的石细胞(硬石)进行了微量化学分析(图1)。通过核磁共振波谱与文献和质谱数据的比较，鉴定了二苯乙烯涩味苷和二氢黄酮醇二羟基槲皮素3′-O-β- d -吡喃葡萄糖苷[2]．

（A）从室外生长的不同高度（5米、15米和20米）的树木中采集树皮碎片。使用新鲜刀片在离地1.5 m的高度纵向切割材料。将冰冷却的条带运输至实验室，并将其嵌入组织冷冻介质中，立即用液氮冷冻，然后保持在-20°C。然后将这些条带在-20°C下冷冻切片成30 mm的切片，并将其安装在标准显微镜玻片上，将其作为样本放入徕卡显微镜中LMD.系统面向下面的部分。

（B）在荧光模式下(激发450 ~ 490 nm，双折射510 nm，发射515 nm)，可将结石细胞与周围的韧皮部细胞区分开来。激光显微解剖的材料通过重力收集在微离心管帽。切除每个样本需要两到三天。过量的冷冻介质排除了向切片边缘收集的石细胞。收集2 h后，取出微管LMD.系统，以避免过度加热收集的植物材料的显微镜灯。

(C)微管的离心使材料沉淀在容器底部。在含有硅胶的TLC罐中，在4ºC的黑暗中干燥材料48小时。温和的条件提供了彻底的干燥，并使核磁共振谱中残留的HDO信号最小化。

(D)在NMR管中进行提取，加入植物物质和氘化甲醇，超声5分钟。随后，^1.H-NMR，^1.H-^1.H COSY谱和HSQC谱记录了两种酚类化合物(如上所述的涩味素和二羟基槲皮素3′-O-β-D-glucopyranoside)的测定。采用芦丁作为内标，对两种酚类化合物进行了定量分析^1.核磁共振。

Phloem parenchyma细胞

虽然成熟的挪威云杉树经常被小蠹虫杀死Ips typographus及其相关的蓝染色真菌，长喙壳属polonica,这种针叶树的某些基因型比其他的更能抵抗树皮甲虫或它们的真菌[12]．挪威云杉的树皮的专门验验薄壁细胞膨胀并在吠叫甲虫及其微生物助理的攻击时改变他们的植物化学含量。LMD.结合^1.采用核磁共振氢谱技术比较了侵染后正常韧皮部薄壁细胞和韧皮部薄壁细胞的化学成分含量C. Polonica.取自挪威云杉的茎皮(图2)[3]．

（A）从同一棵树的正常对照和感染韧皮部薄壁组织细胞中收集树皮片，并在使用前在–80℃下储存。将样品嵌入组织冷冻培养基中，在液氮中快速冷冻，并冷冻切片为40µm厚的切片。

（B）激光显微切割是在徕卡LMD6000系统上进行的C. Polonica.- 形成的样品，未收集感染的细胞本身，但选择感染部位旁边的细胞进行分析。使用两层抑制的岩肺部牙髓细胞之间的细胞层作为筛细胞的来源。每个样本需要耗时的收集3-5小时。每个管的植物材料的采集时间限制为1-2小时，以避免样品材料的热温。

(C)肉眼不可见，样品没有被干燥，直接用氘化甲醇提取并转移到核磁共振管。

(D)^1.立即记录提取物的H-NMR光谱并与酚类参考文献进行比较。芪葡萄糖苷含量含量被显示为位于韧皮薄壁细胞中的主要次级代谢物，并且在相邻筛网中具有显着较低的浓度。Flavonoid（+） - 儿茶素在感染后在Phloem Probyma细胞中出现C. Polonica，虽然在非感染细胞中减少了含量的水平。

LMD作为一种工具来研究黑暗和半透明腺体的代谢谱金丝桃属植物种

贯叶连翘,俗称圣约翰草，是世界上最畅销的药用植物之一。对照临床试验证明，从该植物地上部分提取的制剂可以有效治疗轻度至中度抑郁症［13］．黄酮类化合物，x原烷，生物脂醛，萘代蒽酮，尤其是戊醛如纯血管蛋白和芦荟蛋白，是由属成员产生的主要继发性植物代谢物金丝桃属植物金丝桃科植物的一种［14］．这些化合物分布在多细胞、球状或隧道状的聚集物中，如分泌管，以及黑暗和半透明的腺体。我们选择了现代技术的结合:LMD.和矩阵紫外线- 激光解吸/电离 - 质谱成像（LDI MSI）和经典方法：用有机溶剂提取全植物材料，分离并识别高度局部化紫外线吸收的化合物[4]．

（A）从植物的萼片和花瓣上切除黑色和半透明的腺体穿孔杆菌和h . reflexum它们被固定在薄薄的玻片和专门制造的金属框架之间——类似于用于切除SC的程序扩张器如上所述。

（B）采用Leica LMD6000系统的氮固态二极管激光对花瓣上的黑色腺体和叶子上的黑色半透明腺体进行分离。

(C)将收集的腺体进行短暂离心，并将甲醇添加到微管中。

(D)在简短的超声处理后，将各样品溶液的分配制转移到MALDI板上并在其上干燥，用于LDI-TOF/MS研究。没有必要的电离矩阵，可能是由于强紫外线植物次生代谢产物的吸收。采用LDI-TOF/MS对花瓣黑色腺体、黑色结节和叶片半透明腺体进行激光显微解剖分析，发现不同部位腺体中萘二酮、类黄酮和间苯三酚的化学形态不同。

LMD作为研究盾状腺毛防御性次级代谢物的工具Colquhounia coccineavar。蒙西斯

东南亚属Colquhounia从唇形科植物科植物中分离出colquhounoids a - C，是C属一个特殊类群的新类群₂₅萜类，倍半萜类[15]. 这种植物的叶、芽和茎被一层密集的非陆地毛、盾状和头状腺毛所覆盖。组合LMD.超高效液相色谱/串联质谱（UPLC/MS/MS）用于分析盾状腺毛的植物化学特征（图3）［6］．

（A）刚收获的树叶c . coccineavar。蒙西斯被固定在一个特制的金属框架上。

（B）在徕卡LMD7000系统上安装载玻片后，对腺毛进行显微解剖，并在一个微管中收集500个腺毛。

(C)简短的离心（3,000g，4ºC，3分钟）沉淀在管底部的腺体毛状体。对于萃取，加入丙酮，并在4℃下超声处理10分钟。

(D)上清液经UPLC/MS/MS分析。三个主要化合物:colquhounoids a - c，也从全叶材料的甲醇提取物中分离得到c . coccineavar。蒙西斯通过NMR和X射线衍射明确地发现，在总离子色谱图中，保留时间为25.4,28.9和23.7分钟，并分别在分子量为430,432和448的正ESI质谱中（图4)．

LMD作为揭示次生代谢物在油菜不同组织中分布模式的工具(甘蓝型油菜L.）

油菜籽（甘蓝型油菜）其种植目的是生产生物柴油、动物饲料和植物油供人类食用。全球石油产量的很大一部分（15%）由这种主要的石油作物提供［16］．脂类的主要储存部位是种子的胚。种子的主要次生代谢物显著是硫代葡萄糖苷和酚胆碱酯。虽然这些次生代谢物具有抗营养特性［17］它们对油菜的生物和非生物相互作用具有重要的生态学意义[18]．LMD.用该方法分离了种子的四个组织部分(下胚轴和胚根、内子叶、外子叶、种皮和胚乳)显著相互使用LMD.[5]．

（A）玉米成熟种子显著垂直包埋于组织冷冻培养基中，立即在液氮中冷冻，用低温恒温切片机-24℃冷冻切片成60µm厚切片。

（B）切片直接安装在膜框载玻片上，使用徕卡LMD6000激光显微解剖系统进行解剖。用最强的激光强度和最慢的激光移动速度依次解剖四个不同的组织部位。四个解剖组的材料通过重力收集在单个微管中，包括支撑膜，随植物材料一起切割收获。

(C)然后将显微切割的材料转移到HPLC小瓶中，并添加1 mL 80%（v/v）甲醇以在超声波浴中提取次级代谢物10 min。此外，将sinalbin（10µM）和肉桂酸胆碱酯（10µM）作为内标物添加到提取液中，芥子碱用于硫代葡萄糖苷，肉桂酸胆碱酯用于芥子碱。然后使用阴离子交换固相柱从其他化合物中分离硫代葡萄糖苷。

(D)采用LC-MS对非硫代葡萄糖苷类化合物进行分析。采用LC-DAD/MS分析硫代硫代葡萄糖苷，并与参考文献的质谱数据和保留时间进行比较。结果表明，硫代葡萄糖苷在成熟油菜胚组织中分布均匀。油菜素作为优势酚类化合物在油菜胚组织中的均匀分布支持了油菜素的贮藏功能。此外，非硫代葡萄糖苷部分的化合物，如环亚精胺偶联物只存在于下胚轴和胚根和两种主要存在于子叶中的黄酮类化合物中。

LMD作为去除毛状体的工具大麻大麻素分析方法

大麻是一家年度的脱衣厂。来自东部和中亚的亚洲，它长期以来被培养为传统医学的来源[19]．负责生物活性的化合物欧洲栗似乎是植物大麻素，一种独特的萜酚类化合物，具有烷基间苯二酚和单萜基团。大麻素和精油的主要产地是毛状体，尤其是头柄腺毛。次生代谢物主要在花期的最后5周产生。因此，花期第4 - 8周的腺状毛被LMD.通过LCMS和低温NMR分析大麻素谱。

（A）将苞片和花切成小片(长度0.2-0.5 cm)，用4%磷酸缓冲甲醛固定，真空10 min， -4℃浸泡过夜，用钢框架(pet膜，25 mm × 76 mm)载玻片固定。[20]．

（B）使用徕卡LMD6000显微镜解剖完整的头状茎毛、头和茎以及完整的头状无柄毛。从每个样本中，切除25–143个毛状体，并通过重力在Eppendorf管中收集。然后，将显微切割的材料旋转1分钟，并在微型离心机中离心5分钟。为了避免大麻素的脱羧和降解，解剖后的样品直接储存在-20°C下LMD.［21］．

(C)对于LC-MS分析，向第4、5、6、7和8周的每个显微解剖样品中添加60µL甲醇，超声处理10分钟，并在室温下培养过夜。然后，将样品在H中稀释_2.O/MeOH（2/1，v/v）+0.1%甲酸溶液。对于低温NMR测量，在第8周采集的解剖的头状茎和头状无柄毛状体中添加至少氘化氯仿。超声处理1分钟后，将溶液转移到NMR管中进行分析。

(D)LC-MS和NMR数据识别Δ⁹-四氢大麻酚酸(THCA)和大麻二酚酸(CBDA)是头状柄毛和头状无柄毛的主要化合物。LC-MS分析数据用于对生长周期最后5周收集的微解剖毛状体的大麻素谱进行比较研究。结果表明，所调查的样品具有定性相似性。THCA, CBDA，大麻酚酸，Δ⁹-四氢大麻酚、大麻二酚和大麻酚均在花期样品中检测到。大麻酚和大麻酚仅在第8周采集的完整头状毛及其头部样品中检测到为次要化合物。

我们的概述LMD.基于基础的出版物显示了植物材料的广泛多样性，这些材料可以在细胞水平上获得本地化的植物化学信息(不同植物科不同物种的叶、茎、花和种子材料)。LMD.-基于化学分析的方法可以揭示次生代谢物在特定组织中的不均匀和依赖于植物发育阶段的积累。因此，该方法可用于确定不同的、依赖于器官的次生代谢物生物学功能。此外，还可使用有关代谢物特定定位的信息ful研究生物合成途径、代谢物的修饰及其浓度的调节LMD.例如在特殊制造的滑动系统中直接使用样品材料或在材料冷冻渗滤之前嵌入样品材料。尽管如此，我们意识到为制备每个新样本制定修改或新的分析策略的挑战。分析方法领域的进一步改进可以最小化成功识别所需的材料量。因此，可以减少分析此类组织和化合物的工作负荷，从而允许这些难以分离样品材料。

我们感谢Alexandra zum Felde的编辑帮助。作者感谢Daniel Veit为LMD.．

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