带标记探针的STED显微镜
早期标记的一个挑战是找到适合的荧光染料发生的通过激光激光激发的显微镜，并被刺激发射激光去激发。到目前为止，化学家产生了足够数量的合适化合物来考虑解决这个问题。但是第二个标签问题仍然存在：标记探针的总大小。
一种抗体分子量为150 kDa，长度为10-15 nm，一抗和二抗的结合长度可达30 nm。当使用传统的300纳米分辨率时，这不是问题，但当分辨率为20-40纳米时，标记这种尺寸的探针肯定会带来问题:首先，荧光团距离目标最远可达30纳米;其次，由于空间限制，探针不能与每个目标分子结合，图像往往呈斑点状(图1)。
右:无花果。1:发生的显示通常通过超分辨率显微镜中的抗体染色产生的工件的图像。神经细胞 - 已知是连续结构 - 在人神经母细胞瘤细胞系中与小鼠抗O-糖基化的神经嘧仑M IgG免疫染色。来源：细节Wildanger等人(2009)．
核酸适体-新标记探针的STED显微镜
在西尔维奥·里佐利(Silvio Rizzoli)的团队中，博士后研究员菲利普·奥帕佐(Felipe Opazo)与国际合作者合作发现了一种被称为适体(aptamers)的小型单链寡核苷酸aptus-健美和希腊mero- 部分），非常适合此目的（Opazo等[2012]）.这些寡核苷酸长度为15-100个核苷酸，体外制备，类似于PCR的引物，并在溶液中呈现具有与其他结构的结合亲和力的溶液中的特定三级结构（图2）。由于这种性质，适体仍然被调查为潜在的药物物质，例如抑制疾病相关的蛋白质。
核酸适体比抗体或抗体片段(Fab片段约50 kDa，长度约9 nm)更轻、更小，分子量10-15 kDa，长度可低至2-3 nm。在超分辨率显微镜中，这是足够小的，在20纳米或更低的分辨率下没有问题。而且它们的小体积使得标记几乎所有的抗原成为可能，即使在只有少数抗原的情况下。例如，某些突触囊泡可能每个囊泡只含有10个抗原。由于囊泡大小为45nm，没有足够的空间容纳10个抗体，但10个适配体很容易被容纳。这导致细胞器中的标记密度更高(图3)。
为了找到针对目标结构的适体，选择来自寡核苷酸文库的适体用于结合目标结构。然后通过PCR扩增发现的适体并检查特异性。
适体的一个优势已经很明显:它们可以很容易地选择和生产，而不需要动物或细胞培养设施。开发成本估计在2000到4000欧元之间。一旦序列建立，只需几百欧元就可以在体外生产大量的适配体。
此外，可以选择适体来结合特定的细胞类型，例如特定的癌细胞，甚至不知道它们的实际结合伙伴。这对于抗体来说是不可能的，因为动物不能用整个细胞来免疫。
与单克隆抗体类似，适体通常只识别固定蛋白或天然蛋白，这取决于它们被选择针对哪一种蛋白。
使用Aptamers作为标签探针的主要挑战是确保特异性。很容易找到与目标绑定的适体，但对特异性的测试需要时间和金钱。
真正的结构显示
Silvio Rizzoli组使用的适体来测试使用这些分子的可行性发生的显微镜技术是与纽约爱因斯坦医学院和奥斯汀德克萨斯大学的两个美国研究小组合作开发和使用的，这两个研究小组在使用和开发适配体方面有几十年的经验。他们对核内体的三种蛋白质使用适配体(核内体是一种细胞内的细胞器，参与物质进入细胞(内吞作用))，并将获得的图像与针对相同蛋白质的抗体和标记的天然配体获得的结果进行了比较。
使用适体针对内体的蛋白质，可以可视化100至500nm之间直径的典型圆形内体结构（图4.）.单克隆抗体直接针对相同的表位，这样的结构很难检测:虽然针对TfnR和表皮生长因子受体(EGFR)的适配子发现的核内体样结构的数量与标记的天然配体转铁蛋白和表皮生长因子(EGF)发现的数量密切对应，但单克隆抗体发现的此类结构的数量要低得多。
通过适体，可以看到甚至可以看到诸如富含转化素受体（TFNR）的细胞小管（TFNR）的细节（图5）。
实时成像
有了像适配体这样的小标记探针，就可以看到更小的结构。由于它们的体积更小，活细胞也更容易吸收这些探针，使活成像成为可能。Rizzoli和同事用抗核内体蛋白的适体孵育细胞，能够显示它们与核内体标签alexa488 -转铁蛋白和罗丹明- egf共同定位。
适体识别的大量表位导致非常明亮的染色，允许实时时间流逝超分辨率成像以显示内骨动态。
更好的敏感性
适体染色通常比抗体染色更亮。Rizzoli和他的同事们通过将获得的适配体或抗体染色图像的整体染色强度与单个适配体或抗体的荧光强度进行比较，可以估计出被测试的适配体识别的表位比抗体识别的要多。EGFR适配体识别的表位是PSMA抗体的两倍，而针对前列腺特异性膜抗原PSMA的适配体识别的表位是PSMA抗体的100倍。这证实了一个理论，即更小的适配体使它们能够获得更多的表位。
小，但有多小呢?
使用较小的标记探针显示了在准确性和灵敏度方面的预期效益。但是标签应该多小呢?越小越好?有了适配体，就可以很容易地修改标记探针的大小来解决这个问题。这是通过将额外的核苷酸耦合到结构上实现的。将原来的PSMA适配体大小从15 kDa增加一倍至约31 kDa，大大降低了图像质量，将其增加三倍至约58 kDa则导致图像质量进一步下降。因此，似乎只有最小的探测器才能提供足够精确的图像。
骆驼抗体（纳米型）
西尔维奥·里佐利(Silvio Rizzoli)和其他研究小组测试的另一类小标记是所谓的纳米体。纳米体是从骆驼(美洲驼和骆驼)中获得的单链抗体，分子量约为13 kDa(长度约2至4纳米)，即与适配体大小相同。纳米体的生产开始时就像正常的抗体生产一样，是用抗原对动物(通常是美洲驼)进行免疫。几周后，从动物身上抽取血液，分离出B细胞，选择特定的纳米体，并确定它们的序列。然后，纳米体可以在细菌中重组生产。
纳米体的开发成本估计在8000到10000欧元之间，与单克隆抗体的成本相当。一旦知道纳米体的序列，它们就可以由细菌生产，只留下标记成本。纳米体似乎更适合固定样品，而适配体可能更适合蛋白质复合物或复杂蛋白质。
适用者的其他应用程序
对适体的更多显微镜应用是可能的：根据Silvio Rizzoli，它们可以例如用于ATP或其他化合物的传感器，用于不同类型的烦恼实验，甚至它们在电子显微镜中的应用，与黄金颗粒相结合，都正在测试中。
目前正在调查适体作为癌症治疗的潜在工具。例如，可以针对特异性癌细胞或特异性表达癌细胞表达的受体来选择适体。如果那些适体与毒素或放射性核素偶联，它们可以注射到循环中，特别是癌细胞结合并杀死这些细胞。
第二种可能在肿瘤中的适体应用是它们用于诊断目的的用途：由于它们提供更敏感的染色，这可能导致活组织检查中的更好的癌细胞检测，并且也可能允许使用较小的活组织检查。
个人亮点和观点
西尔维奥·里佐利(Silvio Rizzoli)是最早与他合作的科学家之一发生的显微镜。当被问及他个人的工作亮点时发生的在过去几年中显微镜检查，他提到了三个里程碑：
在第一次生物应用中发生的显微镜（Willig等[2006])、里佐利、斯特凡·赫尔(Stefan Hell)和来自Göttingen的同事使用了这一方法发生的结果表明，突触囊泡的膜蛋白synaptotagmin I在囊泡与突触膜融合后仍然聚集在一起。由于突触囊泡体积小(直径约40纳米)，囊泡内分子致密堆积，使用常规荧光显微镜是不可能做到这一点的。
第二，获得第一个活细胞的视频发生的显微镜（Westphal等[2008])、里佐利、赫尔和来自Göttingen的同事们获得了一系列的延时拍摄发生的视频速率的图像显示活细胞中突触囊泡的运动。
西尔维奥·里佐利的第三个个人亮点是第一个的出版发生的使用适配体作为标记探针获得的接近生物学现实的图像(Opazo等[2012])，如上所述。
现在，用新的小标签探头最佳地适用于超分辨率显微镜的高分辨率，充分潜力发生的最终能够实现生物应用的显微镜检查。