荧光
荧光是一种分子现象的物质吸收光(激励)和辐射光的长波长(发射)的时间很短。荧光染料吸收光时,能量以光子的形式,导致电子激发到更高的能态。吸收光子的过程非常迅速,立即紧随其后返回低能级,然后伴随着发射光子,发射光,可以观察到如果在视觉范围内。
这短时间(纳秒)区分它与其他形式的诸如磷光发光。波长激发和发射峰之间的差异被称为斯托克斯位移。荧光染料具有较大的斯托克斯位移很容易激发,在荧光显微镜观察它们的排放。与透射光照明,斯托克斯位移可能让你无法照射荧光染料的激发峰和观察荧光颜色的发射峰。
共焦激光扫描荧光显微镜使双光子激发光子的时间比发射光波长。然后进入电子激发态与两个光子的一半所需的能量,同时到达。在大多数情况下,电子在激发态一样正常的单光子激发才会降到基态。同样,发出的荧光发射类似于正常的单光子激发。
荧光染料
无机和有机,许多分子荧光发射,尤其是激发使用高能辐射。当植物或动物组织是兴奋紫外线蓝色荧光发射光通常是观察叫做初级荧光,或自发荧光7,8]。天然物质通常有非常广泛的激发和发射光谱。随着分子生物学的发展,研究一直关注特殊与明亮的荧光染料,区别于可能的自体荧光。染料用于选择性地重要的生物分子被称为荧光染料染色。当共轭抗体或核酸,他们被称为荧光标记探针。今天荧光染料与排放峰值可用紫色,蓝色,绿色,橙色,红色,近红外光谱区域的。橙色和红色的光激发的荧光染料的可能性和红色和红外荧光探测,光电倍增管或CCD相机扩展了荧光显微法之外的视觉范围。的激发和发射荧光染料可能转移与细胞环境的变化。有些染料特别选择,因为它们的激发和发射光谱改变,下面的一些离子浓度的变化在细胞内的介质如钙、钠、和pH值。
早期发展epi-illumination荧光显微镜
荧光显微镜的历史回顾的读者被称为卡斯滕(11]。Epi-illumination(垂直入射激发光)已经使用Policard和Paillot32]。几个仪器Leitz则是由(莱卡),博士伦,Reichert蔡司,部分基于建议由我和我的朋友和赫特(4,5),歌手(37)和梅勒,(16,19]。早期Leitz则(莱卡)荧光epi-illumination系统被Haitinger [6]。更多细节上的进化epi-illumination荧光显微镜读者被称为罗斯特(34)和入射光的早期应用荧光显微镜豪泽(7]。
epi-illumination荧光显微镜的主要贡献是引入入射光与色镜紫外线光通过Brumberg和Krylova [2]。Epi-illumination有明确的光学优势,因为与传播照明冷凝器和客观独立的光学轴必须完全一致。目标函数作为冷凝器和进入目标,避免所有对齐问题。从激发光的分离荧光发射,使用双色beamspitter比transmittted光荧光显微法容易得多,这些可能性,然而,并不是导致工业显微镜epi-illumination制造商普遍接受的常规荧光显微镜。主要原因可能是透射光暗视野紫外线激发了已经出色的结果在大多数的应用荧光显微镜(17]。的替换紫外线epi-illumination不会有显著的优势。透射光使用暗视野冷凝器的使用仍然是行业标准,直到60年代末。
分子生物学快速增长的兴趣,然而,发展了许多()单克隆抗体的检测细胞中的重要大分子。研究的详细形态位置几个大分子在细胞细胞器,与不同的颜色越来越多地使用荧光标记。紫外线激励——传统上用于荧光显微镜——并不是最佳适合细胞同时检测多个荧光染料。
大约1962 Ploem开始工作与Schott合作发展的双色beamspitters为蓝色和绿色的光反射使用epi-illumination荧光显微镜。他第一次沟通的时候[1965]和出版与窄带epi-illumination蓝色和绿色的光(21),他不知道发展的二向色分光镜紫外线与入射光激发Brumberg和Krylova2]。Leitz则都是公司,他获得了一个“Opak188金宝搏怎么注册 epi-illuminator中性分光镜。这照明器必须修改为包含一个滑块在入射光路径包含四个二向色分光膜、分别紫外线紫色、蓝色和绿色,激发光。阿姆斯特丹大学开发的这个设备,允许简单的交换不同的二向色分光膜在入射光路径(图1)。激发光的波长可以很容易和快速改变。
不久变得明显的是,与窄带蓝色和绿色的光激发提供了最优的可能性的检测广泛应用免疫荧光标签异硫氰酸荧光素(FITC)和tetramethylrhodamine异硫氰酸酯(TRITC)。使用蓝色和绿色激发也最大限度地降低了组织的自体荧光组件,遇到不良影响与传统传播照明紫外线光。FITC现在可以兴奋与窄带蓝光(使用一个乐队干涉滤光片的一半宽度16 nm),接近励磁最大值490海里(长波长蓝),明确观察绿色荧光的发射峰值在520海里。自发荧光的组织组件是最小化(图2 a和b)导致高图像对比。激发的FITC附近激发最大启用这样的一个有效的激励,即使是高压汞弧灯,没有强大的发射峰的蓝色波长范围,可以使用。此外epi-illumination启用了一个绿色的反映二向色镜首次Feulgen-pararosaniline的激发与强烈的汞排放线在546纳米(图3 a和b)。
在他的第二个出版多epi-illuminator, Leitz则描述原型有四个双色beam-spittters(图1 b), Ploem [22]可以承认Brumberg的贡献和Krylova [2]。难接近的俄罗斯研究时期,没有任何主要的工业发展epi-fluorescence显微镜在俄罗斯或东德早些时候原因Leitz则没有意识到这样的发展。介绍epi-illumination的可能性紫外线光,虽然用于多个应用程序,没有动机Leitz则新技术发展,因为他们已经很好的传播暗视野紫外线激发。增加全球使用常规免疫荧光显微镜在医学诊断和分子生物学的研究,然而,获利的新可能性epi-illumination使用窄带激励和蓝色和绿色的光。188bet怎么注册因为标准高压汞弧灯可以被使用,这似乎太不切实际了。
Leitz则随后开发了一种新型多波长荧光epiilluminator (Leitz则PLOEMOPAK)分别与四个旋转二向色分光膜紫外线、紫色、蓝色和绿色的光13]。Leitz则在一代又一代的照明系统(包含四个二向色分光膜)障碍激发过滤器的过滤器和一个旋转炮塔补充道。最后一个优雅epi-illuminator是由卡夫(15)包含多个组的组合激发过滤器、二向色分光镜和一个障碍或排放过滤器,安装在一个过滤器立方体,也称为过滤块(图4)。因为这照明器允许过滤器方块迅速变成光学光路,多波长相同的照明部分的组织成为一个实用的命题。此外,照明器的四个过滤数据集可以由用户交换(图1 c)。不同的四个过滤数据集可以组装,选择从许多过滤数据集,包含的组合激发、屏障过滤器和二向色分光膜、为不同的应用程序开发。Leitz则由Ploem建议后,也产生了与epi-illumination倒置显微镜(图5 a和b)。复习的Leitz则PLOEMOPAK多波长荧光显微镜照明器,读者被称为Pluta[的审查31日]。
左:图4:Leitz则完成(莱卡)过滤数据集(块)包含:荧光显微镜激发过滤器、二向色分束器和排放(屏障)过滤器。
Leitz则(莱卡)过滤器立方体系统非常有效,现在,39年后,类似类型的过滤数据集仍然是大多数显微镜制造商用于多波长荧光显微镜。这种发展最终导致在徕卡的发展自动化的多波长荧光epi-illuminators容纳八过滤数据集各种波长范围(图5)。在过滤数据集之间切换的时候,电脑显示器像素转变是避免或保持低于35毫米电影的分辨能力由于0-pixel转移技术。这种照明现在用于荧光原位杂交方法(鱼在染色体的研究。
Ploem [24,25,26,27,28),van der Ploeg和Ploem20.)和奈恩Ploem (18)进一步探讨过滤器组合必须为许多生物医学应用程序开发。188bet怎么注册这是Leitz则Schott和合作完成的。Rygaard和奥尔森35)开发了一种新型短波通过高传播干涉滤光片具有非常高的传输对蓝光和一把锋利的截止波长超过490海里。
Ploem [23结合这SP过滤器1毫米GG 455从Schott过滤器,屏蔽了紫外线鲍尔泽激发,并建议开发的一个类似的过滤器(SP560 = 560 KP)激发绿灯和一个过滤器与紫光激发(LP 425 = 425 KP)。后者过滤器应用调查的神经递质(25]。在图6 a和b可以观察到由此产生的蓝色荧光。
从光学行业方面,早期的贡献和评论这些发展是卡夫(写的14],沃尔特[39,40),特拉普(38和赫尔佐格8]。
过滤器用于epi-illumination荧光显微镜的主要类被定义在(a)的主要激发LP(长传球)和过滤器SP(短路)-在德国文学称为KP过滤器和(b)二级过滤器过滤器和排放过滤器(如障碍23]。后者也被称为荧光选择过滤器;这些都是例如用于限制观察的荧光峰值在520海里FITC。最近广泛回顾过滤器在荧光显微镜由Reichman [33]。
Cormane [3)是第一个证明窄带蓝光epi-illumination的荧光标签FITC给了一个最优的人类皮肤疾病的免疫荧光研究对比。透射光激发和紫外线光用来引起这么大的自发荧光的皮肤弹性纤维,所以可视化荧光抗体的严重阻碍。
Leitz则的开创性工作epi-illumination荧光显微法正好在年代全球增长的应用免疫荧光和其他分子生物学方法鱼在医学188bet怎么注册诊断和研究。Hijmans et al。9,10)是第一个证明有用的新Leitz则多波长激发epi-illuminator选择性检测的细胞内某些类的免疫球蛋白,利用抗体与绿色荧光共轭FITC和红色荧光TRITC。他们两个波长激发方法应用使用蓝色和绿色的光和荧光峰的选择FITC由一个排放过滤器在520纳米(图7)。Brandtzaeg [1和克莱因等。12)发表了类似的发现在识别重要的免疫细胞,使用two-wavelength激发Leitz则epiilluminator。染色的血液“玫瑰”的形成,两个波长激发的方法使用紫外线和绿色的光可以证明红细胞在单核细胞(图8)。
Epi-illumination
在epi-illumination二向色分光镜是用来转移向标本的入射光。的光谱特征二向色镜设计以这样一种方式,只有所需的激发波长通过客观向下偏转到标本,而不必要的波长通过二向色镜和收集在一个光阱(15二向色镜背后的)。消除不必要的激发光的结果明显降低杂散光,从而提高图像的对比度。色镜偏转所需的波长(短)激发光通过客观到标本,但对长波长荧光是透明的。抑制滤波器(吸收滤光片)吸收(或反射)反射的光激发标本和透镜表面的目标,但对荧光是高度透明的,从而到达目镜。epi-illumination效率有关的四次方的数值孔径(NA)的一个目标,服务于epi-illumination首次作为观察的冷凝器,然后进入镜头。营销的时候第一个多epi-illuminators只大功率目标(x70, x100)可用高钠(0.95,1.30)。建议由Ploem [21,22],Leitz则是第一个反应过来的制造商产生温和的力量客观目标像油浸x40 NA为1.30(图9)。这种新型的目标,特别是用于epi-illumination荧光显微镜,导致非常明亮图像允许短曝光时间在常规荧光缩微摄影。
右:图9:Leitz则(莱卡)早期(1967)原型(Versuchs)油浸物镜x40 NA 1.30开发荧光epi-illumination技术实验受审。
入射光瞳的最佳填充(孔径)的一个目标
问题epi-illumination荧光显微法一直是最佳的入射光瞳的填充目标图像的光源。媒介放大光源约8倍的典型。这是不同的弧大小相关的各种高压汞和氙气灯。此外,入学的学生的目标相差很大,如3.6毫米x100, NA 0.90 x10客观和12毫米,NA 0.30的目标。此外如果弧可以进入入射光瞳的一部分,将获得的荧光强度减弱。最近Schonenborn [36)报道完全创新的入射光路的莱卡R DM (高碳钢)显微镜。epi-illumination的路径已被设计为允许个人适应特定光源的照明光路用于不同的应用程序。假设克勒在入射光的道路照明,照明光学和收集器的结合是图像光源入射光瞳的目标。对于一个给定的目标,选择放大的光源直接取决于其几何尺寸。卤素灯应很好地调整,自线圈灯灯丝导致一个极端敏感性灯丝失调。相对较低的放大然后为宜。
在某些应用程序中,荧光强度可以增加了1.8和工业应用的因素紫外线甚至在DM R因子3.5 (高碳钢)显微镜。的增加紫外线范围已经由一个新的上色纠正6-lens收集器的特殊高传输玻璃类型。徕卡DM R (高碳钢)现在可以使用显微镜系统两个模块:与HC F模块照明光学放大倍数为11.5,HC射频模块放大倍数为4.8。此外,莱卡R DM (高碳钢)epi-illumination站有一个额外的照明透镜结合HC F模块产生很高的荧光强度和良好的同质性在25毫米的视野。用户需要特别好的同质性甚至有可能脱离HC的照明透镜F模块,只略微降低了荧光强度。图像尺度光源的目标学生从11.5减少到一个值约为9.5,导致增加了约20%的有用的视野。进一步提高均匀性,光学扩散磁盘可以插入模块。有趣的是,它已经被观察到的最美好形象的印象观察荧光时获得的图像强度并非完全不变但略有下降的边缘图像。这种效果是由于眼睛的生理(所谓的“横向缺陷”)。相反,视频与图像分析技术的需求极其恒照明。这可以通过转换光学扩散磁盘HC射频模块的视频模式,导致更多的同质性的核心领域约16毫米(对应于覆盖面积的1/2”与电视适配器x0.5相机)。
徕卡也进一步提高目标荧光显微镜。光学眼镜的选择较低的自发荧光性质导致了增强图像的对比度。
荧光显微镜的一个问题是,没有锐利的图像可以获得较厚的标本。这是由于pre-focal和post-focal飞机的不必要的贡献——使用目标高数值孔径——最后的显微镜图像。这将导致更少的定义良好的图像。徕卡光谱共焦显微镜可以获得大幅拍摄的图像的高分辨率标本中的几个焦点飞机在高横向和纵向分辨率。
多个荧光染料的颜色分离标本进一步提高了光谱分析。计算机辅助光谱共焦扫描显微镜也因此成为荧光显微镜在生物医学的终极工具和材料的研究。188bet怎么注册
过滤数据集在分子生物学各种应用程序
爆炸在分子生物学的应用程序在过去十年已经导致了许多过滤器组合为各种应用程序的发展。现在这些组过滤器安装在一个大的变化过滤数据集(块)。荧光epi-illuminators使2 - 8的交换过滤数据集通过手工操作或机动交换,例如需要荧光杂交研究。本文并不打算提供一个全面和详细的讨论的众多应用程序启用各种过滤数据集。而不是过滤数据集的概述图和关键字,显示可能的应用(表1)。
表1:荧光显微镜应用的例子
这里只列出了光学部件和荧光染料时提到的引用论文。的语言和术语表限制为使用的术语引用的文本文件。过滤器中列出名称术语在德国是斜体。半宽度的带干扰过滤器(BP)可能被作者如+ 00或/ 00 nm,指示中心波长和半功率带宽(例如BP 525/20)或短期和长波半功率点(例如英国石油公司450年- 490年)。短期和长期通过过滤器是由字母标识SP在nm LP和边缘波长(如。SP490年,LP 520或> 520海里)。作者引用的光学零件制造商读者被引用文献。
显微镜、客观、高分子 |
氟- |
光源 |
二向色性 |
发射滤光片 |
激光扫描显微镜(LSC) x20的 |
FITC |
氩激光 |
530 + 30海里& |
|
倒置荧光显微镜x40 |
何 |
DCM激光 |
英国《金融时报》395年% |
450 + 33海里& |
数字荧光显微镜x100/0.60 - 1.32,SP(KP) 630年的面前CCD相机块红色和红外线 |
CY3 |
绿色515 - 560& |
LP 580红# |
|
共焦荧光显微镜x60/1.4 |
FITC |
基于“增大化现实”技术+离子线 |
530年LP噩# |
|
数字荧光显微镜x63/1.4 |
DAPI |
混合动力/氙水银灯 |
||
荧光显微镜 |
TRITC |
Triple-bandpass过滤器* (MBP) |
调频% |
(排放) |
荧光显微镜x100/1.35 |
磅 |
水星100 W |
|
(排放) |
荧光显微镜 |
|
水星100 W |
|
(排放) |
机动epi-illuminator x100/1.3 |
|
水星100 W |
四个过滤数据集@(FC) |
(排放) |
倒置荧光显微镜,CCD |
DAPI |
紫外线 |
发射 |
|
数字荧光显微镜和(CCD)x40/0.75 |
|
多波段通滤波器(MBP) |
Triple-band (polychroic)分光镜(PBS)% ~ |
Triple-band排放过滤器 |
荧光显微镜与机动epi-illuminator延迟发光成像和CCD,x63/1.32 |
级联提单 |
水星100 W |
一个@ |
|
荧光显微镜和电动过滤器更换CCD相机 |
DNA探针: |
英国石油公司&510/20 nm |
Triple-band (polychroic)分光镜(PBS)% ~ |
三重带通排放过滤器: |
荧光显微镜和CCD相机 |
|
水星50 W |
三重带通排放过滤器 |
|
荧光显微镜和CCD相机,x20/0.75 |
|
水星100 W |
|
|
显微镜与CCD相机x30/0.5 |
|
荧光滤光片的手册,六个滑块位置 |
||
特殊的光学系统使用一个分束器polychroic epi-illumination显微镜与波长转换 |
|
水星100 W |
Polychroic PBS% |
|
*排放或激光线。
^短路SP(KP)激发过滤器。
&狭窄的带通(BP)激发过滤器。
~多带通滤波器(MBP)。
%二向色分束器(DBS)或二向色镜(DM)和
% ~Polychroic梁吐唾沫(PBS)。
#吸收滤光片(LP)。
美元发射带通干涉滤光片(英国石油公司),并发射多个带通滤波器(MBP)。
@过滤器立方体,阻挡(FC)。
反射对比显微镜(RCM)
大多数应用的强反射提供了这样一个高对比度这染色可以结合许多古典(吸收)组织化学染色重要大分子中强反射。后者污渍通常可以用来提供细形态取向和在许多情况下,一个更精确的位置immunomarker比单独使用荧光标记的实现。此外,这样的光学显微镜观察可以确认通过电子显微镜检查下一个超薄部分(拥有相同的疣状)新兴市场。
在提升共聚焦显微镜,RCM可以不执行一个特殊的目的或其他杂散光减少光学措施,由于消除杂散光照明通过针孔。大多数吸收应用给一个非常强烈的激光反射和展示非常有限的衰落。他们通常允许使用一个小针孔大小(例如10微米),这是大约五到十倍小于可用于大多数荧光染料在共焦荧光提升显微镜。使用反射immunomarkers因此可以导致一个非常显著增加光学分辨率。标本double-stained与荧光染料和徕卡光谱共焦显微镜提升提供新的可能性为多个标记可以很容易地检查反映immunomarker。
RCM使用荧光显微镜,epi-illuminator高压灯。在荧光epi-illuminator额外偏振器过滤数据集,包含一个偏振镜,反射器,必须插入一个分析器(图12)。也反映对比(RC)隔膜模块(包含中央停止系统)必须在入射光路径中。这个RC隔膜模块适应滑动套中央停止和/或孔径膜片。另外一个特殊的客观发展反射显微镜相比,徕卡RC计划油浸x100/1.25 RCM客观配备一个λ/ 4板在镜头面前,应该添加到设定的目标(荧光显微镜)的炮塔上客观的左轮手枪。
在反射光显微镜,对比基于反射强度的差异(=反射)。在这种类型的显微镜应该提醒的是,光的反射发生在每一个光学边界,这是当折射率和/或吸收指数变化。生物标本显示反射率低于1%,主要是不到0.2%,这几乎是不可能得到反射光图像用传统的显微镜,由于不必要的反射显微镜内管。在反射显微镜相比,两种方法的结合是由于散射光用来减少眩光。入射光制成一个环状光锥的插入中央停止(孔径光栏提供了一个中央停下来,创建一个环形孔径)在入射光路径在一个平面共轭焦平面(孔径)的目标。第二种方法,减少不必要的分散的反射光通过“抗折断”的使用方法。反射光显微镜内抑制利用交叉偏振器,结果只有光反射的标本被传递到眼睛。客观的,目的是提供一个四分之一波长板前透镜的目标。光的传递通过λ/ 4板向上(向下的标本和反射后的标本)改变光的偏振方向与2 x 45°= 90°。
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