荧光
荧光是一种分子现象，物质吸收光(激发)，并在很短的时间内辐射较长波长的光(发射)。当荧光色素吸收光时，能量以光子的形式被吸收，导致电子激发到更高的能态。光子的吸收过程极其迅速，并立即返回到较低的能量状态，然后伴随着光子的发射，如果在可视范围内发射光，就可以观察到光子的发射。
这种短的持续时间(纳秒)使它区别于其他形式的发光，如磷光。激发峰和发射峰之间的波长差被称为斯托克斯位移。具有较大斯托克斯位移的荧光色素易于激发并在荧光显微镜下观察其发射。通过透射光照明，一个小的斯托克斯位移可能使它不可能照亮荧光染料在其激发峰和观察荧光颜色在其发射峰。
共聚焦激光扫描荧光显微镜使双光子激发比发射光的波长更长的光子。然后，电子被两个能量只有所需能量一半的光子带入激发态，同时到达。在大多数情况下，电子最终处于与正常单光子激发相同的激发态，然后下降到基态。同样地，发射的荧光与普通单光子激发的荧光相似。
荧光染料
许多分子，无论是无机的还是有机的，都表现出荧光发射，特别是在高能辐射激发下。当植物或动物组织受到刺激时紫外线-光通常观察到一种蓝色荧光发射，称为初级荧光或自体荧光[7，8］．自然产生的物质通常具有非常广泛的激发光谱和发射光谱。随着分子生物学的发展，人们对具有明亮荧光的特殊染料进行了研究，以区别于可能存在的自体荧光。用于选择性染色生物学上重要分子的染料被称为荧光染料。当与抗体或核酸结合时，它们被称为荧光标记物或探针。今天，荧光剂的峰值发射在光谱的紫色、蓝色、绿色、橙色、红色和近红外区域。有可能激发荧光染料与橙色和红色的光，并检测红色和红外荧光与光电倍增管或CCD-相机将荧光显微镜扩展到视觉范围之外。荧光色素的激发和发射可随细胞环境的变化而变化。有些染料被特别选择是因为它们的激发或发射光谱随着细胞内介质中某些离子(如钙、钠和pH值)浓度的变化而改变。
外延荧光显微术的早期发展
要回顾荧光显微镜的历史，读者可参阅Kasten [11］．外射照明(垂直入射的激发光)已经被Policard和Paillot使用了[32］．一些仪器是由Leitz(徕卡)，博士伦，Reichert和蔡司制造的，这部分是基于Ellinger和Hirt [4，5]，歌手[37梅勒和匹克[16，19］．早期的Leitz(徕卡)荧光外延照明系统是由Haitinger [6］．欲了解更多外延荧光显微术的发展细节，读者可参阅Rost [34]以及早期应用于Hauser的入射光荧光显微镜[7］．
外延照射荧光显微镜的一个主要贡献是引入了用于入射照明的二色镜紫外线Brumberg和Krylova的灯光[2］．外射照明有明确的光学优势，因为不像透射照明，其中聚光镜和物镜有独立的光轴，必须完全对准。这个物镜既可以作为聚光镜，也可以作为集光物镜，避免了所有对准问题。使用二向色光束喷射器从激发光中分离荧光发射比使用透射光荧光显微镜容易得多。然而，这些可能性并没有导致工业显微镜制造商普遍接受常规荧光显微镜的外延照明。其主要原因可能是透射光暗场紫外线激发在荧光显微镜的大多数应用中已经取得了很好的结果[17］．将其替换为紫外线外溢照明不会有明显的优势。使用暗场聚光镜的透射光一直是行业标准，直到60年代后期。
然而，人们对分子生物学兴趣的迅速增长导致了许多(单克隆)抗体的发展，用于检测细胞中重要的大分子。为了研究几种大分子在细胞器中的详细形态位置，越来越多地使用不同颜色的荧光标记。紫外线激发-传统上用于荧光显微镜-不是最适合同时检测细胞中的多种荧光色素。
1962年左右，普洛姆开始与肖特合作开发二向色光束喷射器，用于反射蓝色和绿色光线，用于荧光显微镜的外显照明。在他第一次交流[1965年]和发表关于窄带蓝绿光外延照明的文章时[21]，他没有意识到二色分束器的发展紫外线布伦伯格和克雷洛娃的入射光激发[2］．莱茨公司也是如此，他从该公司获得了带有中性分188金宝搏怎么注册束器的“Opak”外显照明器。这个照明器必须被修改，以在入射光路中包含四个二向色分束器的滑块，分别用于紫外线、紫色、蓝色和绿色激发光。该装置由阿姆斯特丹大学开发，允许在入射光路中容易地交换不同的二向色分束器(图1a)。因此，激发光的波长可以容易而迅速地改变。
很快，窄带蓝光和绿光激发为检测广泛使用的免疫荧光标记异硫氰酸荧光素(FITC)和异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)。使用蓝色和绿色激发也减少了组织成分的自发荧光，这是传统透射照明所遇到的不良影响紫外线光。FITC现在可以用窄带蓝光(使用半宽为16 nm的带干涉滤光片)激发，在490 nm处接近激发最大值(长波长蓝)，在520 nm处清晰地观察到绿色荧光峰值发射。组织成分的自体荧光被最小化(图2a和b)，导致高图像对比度。激发的FITC在接近它的激发最大值时，即使是在蓝色波长范围内没有强发射峰的汞高压电弧灯也可以使用。此外，绿色反射二向色镜的外延照明首次使feulgen - parroosaniline在546 nm处的强汞发射线激发(图3a和b)。
在他关于多波长外显光源的第二篇论文中，他描述了一个具有四个二色射束的Leitz原型(图1b)， Ploem [22可以承认布伦伯格和克雷洛娃的贡献[2］．在那个时期，俄罗斯的研究无法进入，而且在俄罗斯或东德没有任何重大的外延荧光显微镜工业发展，这是Leitz之前没有意识到这种发展的原因。引入外延照明的可能性紫外线光虽然在许多方面有用，但在莱茨并没有成为新技术发展的动力，因为他们已经有了很好的传输暗场紫外线激发。然而，在医学诊断和分子生物学研究中，常规免疫荧光显微镜在世界范围内的使用越来越多，可以受益于使用蓝色和绿色光的窄带激发的外显照明的新可能性。188bet怎么注册由于可以使用标准的高压汞弧灯，这似乎是一个切实可行的提议。
随后，Leitz开发了一种新型的多波长荧光分束器(Leitz PLOEMOPAK)，分别用于四个旋转的二向色分束器紫外线、紫色、蓝色及绿光[13］．在连续几代的莱茨照明器(包含四个二色分束器)中，增加了阻挡滤波器和用于激发滤波器的旋转炮塔。最后，一个优雅的外照灯由卡夫[15]，包含多组激励滤光片、二向色分束器和阻挡或发射滤光片的组合，一起安装在滤光块(也称为滤光块)中(图4)。由于这种照明器允许滤光块快速转换为光学光路，对同一部分组织进行多波长照明成为一个实际的命题。此外，照明器中的四个滤镜立方体可以由用户交换(图1c)。可以从许多滤波器立方体中选择不同的四个滤波器立方体组合，包含激励、势垒滤波器和二向色分束器的组合，用于不同的应用。根据Ploem的建议，Leitz还生产了一种带有外显照明的倒置显微镜(图5a和b)。对于用于多波长荧光显微镜的Leitz PLOEMOPAK照明器的综述，读者可参考Pluta [31］．
左:图4:用于荧光显微镜的完整Leitz(徕卡)滤波器立方体(块)，包含:激发滤波器，二向色分束器和发射(势垒)滤波器。
Leitz(徕卡)滤镜立方体系统是如此高效，现在，39年后，类似类型的滤镜立方体仍然被大多数显微镜制造商用于多波长荧光显微镜。这一发展最终导致徕卡内部开发出自动化多波长荧光外显照明器，可容纳8个不同波长范围的滤光立方体(图5c)。当在过滤器立方体之间切换时，由于0像素移位技术，计算机显示器上的像素移位可以避免或保持在35毫米胶片的分辨率以下。这种光源现在用于荧光原位杂交方法(鱼)在染色体研究中。
Ploem [24，25，26，27，28]，范德普洛格及普罗姆[20.奈恩和普罗姆[18]进一步探索了必须为许多生物医学应用开发的过滤器组合。188bet怎么注册这是与Schott和Leitz合作完成的。Rygaard和Olson [35]开发了一种新型短波通高传输干涉滤波器，具有非常高的蓝光透射率，并对波长大于490纳米的波长有锐利的截断。
Ploem [23结合起来SP过滤器与1毫米GG 455过滤器从Schott，堵塞紫外线激发，并建议Balzers开发类似的滤波器(SP560 = KP 560)用于绿光激励和紫光激励的滤波器(LP 425 = KP 425)。后一种过滤器应用于神经递质的研究[25］．在图6a和b中可以观察到产生的蓝色荧光。
从光学行业的角度来看，早期对这些发展的贡献和评论是由Kraft [14]， Walter [39，40]、特拉普[38和赫尔佐格[8］．
在外延照射荧光显微镜中使用的滤光片的主要类别定义在(a)初级激发滤光片LP(长通)和SP(短通)-在德国文献中称为KP滤波器-和(b)二级滤波器，如阻挡滤波器和发射滤波器[23］．后者也被描述为荧光选择过滤器;例如，这些被用来限制观察到520纳米处的荧光峰值FITC．最近，Reichman对荧光显微镜过滤器进行了广泛的回顾[33］．
Cormane [3.]首次证明了窄带蓝光对荧光标签的外延照射FITC给出了人体皮肤疾病免疫荧光研究的最佳对比。透射光激发与紫外线光用来引起皮肤中弹性纤维的强烈自发荧光，因此荧光抗体的可见严重受阻。
莱茨在外延照射荧光显微镜方面的开创性工作与70年代世界范围内免疫荧光和其他分子生物学方法应用的增加相吻合鱼在医学188bet怎么注册诊断和研究方面希曼斯等人。[9，10]是第一个证明了新的莱茨多波长激发外显光源的有用性，用于细胞中某些类别的免疫球蛋白的选择性检测，使用抗体偶联绿色荧光FITC红色荧光TRITC。他们采用双波长激发法，利用蓝色和绿色的光和选择峰荧光FITC(图7)。Brandtzaeg [1]和克莱因等人。[12]在识别免疫重要细胞类型方面也有类似的发现，使用双波长激发与莱茨外照器。在染色后的血液中形成“莲座”，采用双波长激发法紫外线绿光可以显示单个核细胞周围的红细胞(图8)。
Epi-illumination
在外延照明中，用二向色分束器将入射光偏转到试样上。二向色镜的光谱特性是这样设计的，只有所需的激发波长通过物镜向下偏转到样品上，而不需要的波长则由二向色镜传输并收集在光阱中[15]在二色镜后面。这种不需要的激发光的消除导致杂散光的显著减少，从而提高了图像对比度。二色镜通过物镜将所需的(短波长的)激发光偏转到样品上，但对较长的荧光波长是透明的。抑制滤光片(阻挡滤光片)吸收(或反射)从样品和物镜的透镜表面反射的激发光，但对荧光高度透明，因此荧光可以到达目镜。外显照明的效率与物镜数值孔径(NA)的四次方有关，在外显照明中首先作为聚光镜，然后作为集光透镜进行观测。在销售第一批多波长外显光源时，只有高功率物镜(x70, x100)具有高NA(0.95, 1.30)。以下是Ploem的建议[21，22]， Leitz是第一家生产中等功率物镜的制造商，如NA为1.30的油浸x40物镜(图9)。这种新型物镜，特别为外照荧光显微镜设计，可在常规荧光显微摄影中获得非常明亮的图像，允许短时间曝光。
右:图9:Leitz(徕卡)早期(1967年)原型(“Versuchs”)油浸物镜x40, NA 1.30，用于荧光外露照明技术的试验实验。
物镜入口瞳孔(孔径)的最佳填充
外照荧光显微镜中的一个问题是物镜的入口瞳孔与光源的图像的最佳填充。光源的中等放大倍数约为8倍是典型的。这与各种高压汞灯和氙灯的电弧大小不同有关。此外，物镜的入口瞳孔差异很大，例如，x100物镜为3.6毫米，NA 0.90物镜，x10物镜为12毫米，NA 0.30物镜。此外，如果只有部分电弧能进入入口瞳孔，则所获得的荧光强度会降低。最近Schönenborn [36报道了一个完全创新的入射光路在徕卡DM R (高碳钢)显微镜。用于外延照明的路径现在已被设计为允许对用于不同应用的特定光源的照明光路径进行单独的适应。假设入射光路中有克勒照明，照明光学和收集器的组合是对物镜入口瞳孔中的光源进行成像。对于给定物镜，光源放大倍数的选择直接取决于物镜的几何尺寸。卤素灯应该很好地调节，因为灯丝的线圈对灯丝失调非常敏感。相对较低的放大倍数是可取的。
在某些应用中，荧光强度可提高1.8倍，在工业应用中紫外线相差3.5倍(高碳钢)显微镜。增加了紫外线范围已支持一个新的彩色校正6透镜收集器的特殊高透射玻璃类型。对于徕卡DM R (高碳钢)显微镜系统现在有两个模块:HC F模块的照明光学放大系数为11.5,HC RF模块的放大系数为4.8。此外，徕卡DM R (高碳钢)外显照明支架有一个额外的照明透镜与HC F模块相结合，在25毫米的视野内产生非常高的荧光强度和良好的均匀性。需要特别好的同质性的用户甚至可以拆卸HC F模块的照明透镜，这只会略微降低荧光强度。光源在物镜瞳孔中的像标从11.5减小到约9.5的值，导致有用视场增加约20%。为了进一步提高均匀性，可以在模块中插入光学扩散盘。有趣的是，已经观察到，当图像强度不是完全恒定的，但稍微下降到图像的边缘时，最令人愉快的图像印象用于观看荧光。这种效果是眼睛生理机能的结果(所谓的“外侧发育迟缓”)。相反，具有图像分析的视频技术需要极其恒定的照明。这可以通过将HC RF模块中的光学扩散盘切换到视频模式来实现，从而在大约16毫米的中心场中产生更均匀的效果(对应于带有电视适配器x0.5的1/2英寸摄像机所覆盖的区域)。
徕卡还进一步改进了荧光显微镜的物镜。选择具有低自发荧光特性的光学玻璃，可提高图像对比度。
荧光显微镜的一个问题是，从相对较厚的标本中无法获得清晰的图像。这是由于焦前和焦后平面(使用具有高数值孔径的物镜)对最终显微镜图像的不必要贡献。这导致图像定义不明确。然而，徕卡光谱共聚焦显微镜可以在高水平和垂直分辨率下从标本内的几个焦平面获得高分辨率的锐利图像。
通过光谱分析，样品中多种荧光染料的分色性能得到了进一步的提高。因此，计算机辅助光谱共聚焦扫描显微镜已经成为荧光显微镜在生物医学和材料研究中的终极工具。188bet怎么注册
过滤立方体在分子生物学中的各种应用
在过去的十年中，分子生物学应用的爆炸导致了许多过滤器组合的各种应用的发展。这些过滤器现在被安装在大量的过滤器立方体(块)中。荧光外显照明器可通过手动操作或电动交换2-8个过滤立方体，例如在荧光杂交研究中需要的交换。本文不打算全面详细地讨论各种筛选器多维数据集所支持的众多应用程序。相反，只给出了过滤器多维数据集和关键字的概览示意图，指出了可能的应用(表1)。
表1:荧光显微镜应用的例子
在引用的论文中，只有光学部件和荧光染料被列在这里。本表中的语言和术语仅限于被引论文文本中使用的术语。德文中的筛选器名称术语以斜体列出。带干涉滤波器(BP)的半宽可被作者称为+00或/00 nm，表示中心波长和半功率带宽(如BP 525/20)或短波和长波半功率点(如BP 450-490)。短通和长通滤波器由字母来标识SP和LP和边缘波长，单位为nm(例如。SP490, LP 520或>520 nm)。对于作者对光学部件制造商的参考资料，读者可参考所引用的文献。
显微镜，物镜，大分子 |
氟- |
光源 |
二向色性 |
发射滤光片 |
激光扫描显微镜(LSC) x20 |
FITC |
氩激光 |
530 + 30纳米＆ |
|
倒置荧光显微镜x40 |
何 |
DCM激光 |
英国《金融时报》395年％ |
450 + 33 nm＆ |
数字荧光显微镜x100/0.60-1.32，SP(KP) 630在前面CCD摄像头可以阻挡远红光和红外光 |
CY3 |
绿色515 - 560＆ |
LP 580红＃ |
|
共聚焦荧光显微镜x60/1.4 |
FITC |
基于“增大化现实”技术+离子线 |
Lp og 530＃ |
|
数字荧光显微镜x63/1.4 |
DAPI |
混合/氙气水银灯 |
||
荧光显微镜 |
TRITC |
三带通滤波器* (MBP) |
调频％ |
(排放) |
荧光显微镜x100/1.35 |
磅 |
汞100w |
|
(排放) |
荧光显微镜 |
|
汞100w |
|
(排放) |
电动外照灯x100/1.3 |
|
汞100w |
四个过滤方块@(FC) |
(排放) |
倒置荧光显微镜，CCD |
DAPI |
紫外线 |
发射 |
|
数码荧光显微镜及(CCD) x40/0.75 |
|
多带通滤波器(MBP) |
三波段(多色)分束器% ~ |
三波段发射滤波器 |
带有电动外显光源的荧光显微镜，延迟发光成像和CCD, x63/1.32 |
级联提单 |
汞100w |
一个@ |
|
带有电动滤光器的荧光显微镜CCD相机 |
DNA探针: |
英国石油公司＆510/20 nm |
三波段(多色)分束器% ~ |
三带通发射滤波器: |
荧光显微镜CCD相机 |
|
水星50 W |
三带通发射滤波器 |
|
荧光显微镜和CCD相机,x20/0.75 |
|
汞100w |
|
|
显微镜与CCD相机x30/0.5 |
|
手动，六个位置滑块的荧光过滤器 |
||
使用多色分束器进行波长切换的外照显微镜专用光学系统 |
|
汞100w |
Polychroic PBS％ |
|
*发射或激光线。
^短路SP(KP)励磁滤波器。
＆窄带通励磁滤波器。
～多带通滤波器(MBP)。
％二向色分束器(DBS)或二向色镜(DM)和
% ~多色光束喷溅器(PBS)。
＃屏障过滤器(LP)。
＄发射带通(BP)干涉滤波器和发射多带通滤波器(MBP)。
@过滤器立方体、块(FC)。
反射对比显微镜(RCM)
大多数免疫染色的强反射提供了如此高的对比度，这种染色可以与许多经典的(吸收性)组织化学染色相结合，用于显示中等强反射的重要大分子。后者染色通常可用于提供良好的形态定位，在许多情况下，比单独使用荧光标记可实现更精确的免疫标记位置。此外，这种光学显微镜观察可以通过电子显微镜检查下一个超薄切片(具有相同的免疫染色)来确认新兴市场．
在共聚焦激光扫描显微镜中，RCM可以在没有特殊物镜或其他减少杂散光的光学措施的情况下进行，因为通过针孔照明来消除杂散光。大多数吸收性免疫染色剂对激光有很强的反射，并显示出非常有限的褪色。它们通常允许使用小针孔尺寸(例如10微米)，这大约比共聚焦荧光激光扫描显微镜中使用的大多数荧光色素小5到10倍。因此，使用反射免疫标记物可以显著提高光学分辨率。用荧光染料和徕卡光谱共聚焦激光扫描显微镜对标本进行双重染色，为多种标记提供了新的可能性，可以很容易地检查反射免疫标记。
RCM使用荧光显微镜支架，外显光源和高压灯。在荧光外显照明器中，必须插入一个额外的偏振器过滤器立方体，其中包含偏振器、反射器和分析仪(图12)。此外，一个反射对比度(RC)膜片模块(包含中央停止系统)必须引入入射光路。这种RC膜片模块适应滑动组与中央停止和/或孔径膜片。此外，用于反射对比显微镜的特殊物镜，徕卡RC M-plan油浸x100/1.25 RCM物镜，在前透镜处配备λ/4板，应添加到物镜转轮枪炮塔上的物镜组(用于荧光显微镜)中。
在反射光显微镜中，对比度是基于反射强度(=反射率)的差异。在这种类型的显微镜中，应该提醒光的反射发生在每一个光学边界，即当折射率和/或吸收指数变化时。对于反射率小于1%和大多数小于0.2%的生物标本，由于显微镜管内不必要的反射，用常规显微镜几乎不可能获得反射光图像。在反射对比显微镜中，使用两种方法的组合来减少由于散射光引起的眩光。通过在入射光路与物镜的后焦(孔径)平面共轭的平面上插入一个中心止点(具有中心止点的孔径膜片，形成环形孔径)，使入射光形成环形锥状光。作为第二种方法，不需要的散射反射光通过使用“反挠性”方法来减少。在显微镜内反射的光通过使用交叉偏振器被抑制，结果只有从标本反射的光被传递到眼睛。为此目的，在物镜的前透镜中设置物镜的四分之一波片。光通过λ/4板(向下到样品，从样品反射后向上)改变光的偏振方向2 x 45°= 90°。
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源
科学技术情报CDR 5:1 - 16 (2001)