浸没目标：使用油，甘油或水来克服一些分辨率的一些限制

其中一个主要问题光学显微镜是为了克服光学分辨率的一些限制，并提高系统的NA。在短暂的,NA.目标是能够从标本中收集光明，而分辨率是目标能够区分标本中细节的能力。

决议和NA将被覆盖在其他文章，但我们现在将研究可用于显微镜的浸泡技术，这种技术允许在高放大倍数下对标本成像，同时克服了一些分辨率的限制。

具有浸入液体代替前部之间的气隙镜片一个客观的标本的盖子玻璃增加了目标的分辨率。当光从一个介质从一个介质转移到另一个媒体（例如，通过玻璃到空气），它折射 - 换句话说，它弯曲和散发。任何光线折射到空气中，被覆盖玻璃反射或实际上被物镜前部的金属外壳阻挡，都无助于成像的形成。浸渍液的目的是降低来自试样的光的折射量和光的反射，并增加目标捕获该否则偏离的光的能力（S.figure 1）。

光线所经过的介质的物理性质决定了光线被折射的程度。“折射率”是一个数值(没有单位)，它决定了光线通过材料时的折射程度。空气的折射率为1.0，而显微镜载玻片和盖玻片的折射率通常为1.5。考虑到这一差异，浸泡液体的目的是匹配(尽可能接近)样品所在玻璃的折射率，从而增加形成最终图像的光线量。随后，大多数浸渍油的折射率为1.51。常用折射率见表1。

理想的场景是创造所谓的“同质沉浸系统”。使用该系统，有可能达到最大的分辨率和NA。均匀浸没系统的目的是(尽可能地)匹配物镜前透镜的折射率和NA、浸没介质、覆盖玻璃/玻片、安装介质和(原则上)聚光镜的透镜(见图2和表1)。

在冷凝器的透镜上放置浸入液体通常是不必要的。如果显微镜被正确地设置和对齐，以实现最佳的对比度和整个样品的照明(见科勒照明的文章)，那么冷凝器的位置和设置将被优化，从而有助于显微镜系统的整体NA。

使用显微镜物镜时需要考虑的另一个因素是“工作距离”。这仅仅是物镜前镜头和覆盖玻璃表面之间的实际距离，当标本在锐焦点(s.图3)。当物镜移动到更接近载玻片，焦平面进一步移动到标本。然而，这在物理上受到限制，因为物体只能移动到与盖玻璃接触的地方。188金宝搏的网址在工作距离和每个目标的放大率之间有一个反比关系。例如，10倍物镜的工作距离可能为4毫米，而100倍油物镜的工作距离通常为130毫米。相比之下，一些水浸/水浸物镜的工作距离约为3毫米。工作距离是另一个通常镌刻在物镜筒上的信息，缩写为“WD”(不要与水浸物镜混淆，见下文)。

• 首先用低放大率的物镜查看你的样本，找到你幻灯片上感兴趣的区域。
• 工作到40x目标并设置显微镜以进行Koehler照明。
• 在40倍和100倍目标之间摇摆炮塔(容纳目标的炮塔)，但不要完全与高功率目标交战。
• 同时从显微镜的一侧观察，仔细地将一滴浸没的油直接滴在盖玻片上。把高倍物镜摆到合适的位置(继续从侧面看舞台)，先用粗焦，再用细焦，使物镜的前镜头与油接触。188金宝搏的网址有些油物镜的前镜头是凹的，这意味着你还应该在物镜上加一滴油，以防止气泡被困在凹镜头里。
• 然后你可以再次俯视目镜。仅使用微细量来调整视野。尽管高功率目标具有弹簧鼻，但在该阶段的粗焦点可以容易地导致盖子玻璃或滑动裂缝，并且还可以损坏目标前透镜。
• 即使您打算检查其他幻灯片，您应该从该阶段从目标中取出油，以防止可能污染显微镜的其他部分。浸没油可以（和将）渗透和损坏显微镜部件和不适合浸没的目标。使用透镜清洁组织拆下多余的油，透镜横扫单次扫描。继续用一块清洁的组织擦拭物镜前镜头，直到没有油痕迹。可获得商业油除去溶液或少量的二甲苯可用于最终清洁透镜。再次，检查一下是很重要的建议在将任何解决方案应用于镜头之前，来自客观制造商。

在研究级显微镜(通常是共聚焦显微镜)上较不常见的浸泡物镜是“水浸”物镜，通常在物镜筒上缩写为“WI”或“W”。当对细胞培养基中的活细胞进行成像时，强烈推荐使用水浸物镜。有两种类型的水浸目标(图5)-“水浸”和“水浸”(通常缩写为“WD”在目标桶上，不要与“工作距离”混淆)。

水浸出物体通常与直立显微镜配置一起使用，并用于直接浸入水或水基培养基/缓冲液中。制造浸渍物体以提供非常长的工作距离。它们也用陡峭的鼻件制造，该鼻部由诸如陶瓷的惰性材料构成。水浸物目标以类似于漏油物镜的方式使用，但用水来代替油滴。

使用水浸物镜的优点之一仅仅是水用作浸渍介质。这显然很容易涂抹和清理。此外，您不需要根据您进行的成像，您不需要使用特定的浸入油，您也没有使用显微镜制造商指定的浸入介质和目标。然而，当使用水浸泡物镜时存在一些缺点。与含水物镜相比，漏油物镜可实现更高的分辨率。另外，由于水的粘度（与油相比），使用水浸泡物镜可以容易受到振动和小空气运动的影响。通过确保将显微镜放置在防振台上，可以克服这种人工制品。或者，更简单的解决方案是放置一个特殊的环，坐落在滑动件上以产生一小池水。水浸目标的最终缺点是它们的成本。一些水浸的目标可以花费尽可能多的研究级显微镜。

Leica提供水浸式微型分配器，克服了长期活细胞成像或筛选实验期间的水蒸发问题。图6）。

总的来说，在成像活细胞和组织时，水浸物目标的主要优点。这主要是由于油浸泡目标不适合通过用于活细胞显微镜的细胞或组织室成像。

生活细胞通常包含在腔室内以及被细胞介质（或缓冲液）覆盖。腔室（和介质）有助于确保细胞或组织保持在稳定的环境中，同时成像。结果，最佳焦距将距离腔室的盖子相对较长。这使得油浸物体的短工作距离不适合通过盖玻璃/室，介质/缓冲液和实际细胞/组织成像。

此外，使用油浸物目的观察水性介质内的细胞会增加额外的折射问题，因为油和水具有不同的折射率。

在观看腔室内的活细胞时，光路将遇到不同的折射率。腔室/盖玻片的材料和覆盖细胞或组织的水性介质将各自具有不同的折射率。形成样品图像的光将在每个阶段折射，这可以导致球形像差。

尽管折射可能发生在水，玻璃或塑料界面，水浸物镜通常校正这一点。此外，一些水浸目标有校正铤。这些围绕物镜筒的环可以调整以适应不同厚度的罩杯。

徕卡还提供电动校正领目标它允许对目标进行精确和远程调整，确保在对样品和成像设置的破坏最小的情况下恢复最佳分辨率(s.图7)。

最后，最适合的水浸目标应用之一是共聚焦成像实时细胞，因此，它们通常是许多共焦系统的标准特征之一。由于水与油的低粘度，使用这些目的导致盖板上的表面张力较小，这意味着样本的位移的机会较小，特别是在获取Z堆叠期间。