材料和方法
细胞培养
人U2OS骨肉瘤细胞稳定表达绿色荧光蛋白-BMI1源于荷兰阿姆斯特丹Antoni Van Leeuwenhoek Ziekenhuis癌症研究所Maarten Van Lohuizen教授的实验室。我们从Assoc实验室获得了这些细胞。Dušan Cmarko，布拉格查尔斯大学教授。小鼠3T3细胞是荷兰阿姆斯特丹大学斯瓦默丹生命科学研究所的Paul Verbruggen博士慷慨赠送的。U2OS和3T3细胞在含10%胎牛血清的D-MEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle medium, PAN Biotech, GmbH, Germany)中培养。培养在37°C、含5% CO的湿化气氛中进行2．
诱导DNA双立断裂
U2OS细胞稳定表达绿色荧光蛋白在标准条件下培养稳定表达EGFP-HP1b的-BMI1和3T3细胞。局部照射前16 ~ 18 h，用10 μM 5-溴-2 ' -脱氧尿苷(BrdU)致敏细胞。使用BrdU标记(Roche， #11296736001)对对照和tsa处理的U2OS和3T3细胞进行染色。照射brdu致敏细胞紫外线激光(355海里)。我们用80%的激光输出辐照一半的核或确定的条带，在声光可调谐滤波器(AOTF)不减少。使用如下设置:格式512 × 512像素，400hz，双向模式，64行，放大> 5-10x。照射后，细胞在4%多聚甲醛和磷酸化组蛋白H2A中固定。用兔gH2A多克隆抗体免疫荧光法检测X (gH2AX)。X(磷S139;Abcam # ab2893)。为了观察免疫荧光后局部微照射的活细胞和固定细胞，我们使用了共聚焦显微镜。这些分析使用白光激光(WLL, 470-670 nm, 1 nm增量)在554 nm连接到共聚焦显微镜徕卡TCSsp5x .为了观察生物物体，我们使用了64倍的放大倍数和数值孔径N.A. = 1.4。
图1:BMI1蛋白的乙酰化依赖募集紫外线受损的染色质。(一)现场控制绿色荧光蛋白-BMI1-U2OS细胞在照射后100 s内监测，在~15 s内检测到DNA病变处BMI1蛋白的积累。紫外线-辐照区域gH2AX阳性(红色)，DAPI染色细胞核(蓝色)。(b) SAHA(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)可防止BMI1的积累紫外线受损的染色质。
结果
这里，355 nm诱导DNA损伤紫外线激光。照射后，用白光激光(WLL)监测活细胞，在延时显微镜下显著消除光漂白(图1)。检测到磷酸化H2AX (gH2AX)的存在，作为染色质双链断裂(DSBs)的标记(图1，红色条)。在微辐照的U2OS细胞中，我们观察到Polycomb群相关的BMI1蛋白的显著积累(图1a)。然而，当使用HDAC抑制剂SAHA处理细胞时，在DNA病变处检测到的BMI1积累没有增加(也没有完全缺失)(图1b)。这些实验指出，乙酰化事件是识别的重要角色紫外线受损的染色质。
在下一步，我们询问BMI1是否与其他异染色质相关蛋白如HP1b相互作用紫外线受损的染色质。我们观察到HP1b在紫外线受损区域缓慢;照射200 s后(图2a)， BMI1招募到紫外线-受损的染色质紫外线-射线(图1)。
TSA抑制组蛋白去乙酰化酶也阻止了HP1b蛋白的招募紫外线细胞经TSA处理后，与BMI1蛋白观察结果相似(图1b和2b)。
图2:HP1b的招募紫外线-受损染色质受组蛋白乙酰化状态影响。(一)现场控制绿色荧光蛋白(b) TSA(一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂)阻止了HP1b向受损染色质的招募，然而，在TSA处理的细胞的微辐射区域中，HP1b并没有消失。
总结
综上所述，我们发现pcg相关的BMI1蛋白被招募到紫外线-损伤的染色质在微辐照后立即恢复，随后明显恢复绿色荧光蛋白-HP1b。然而，我们知道的生理意义紫外线微辐照可能是有限的，正如外源性BMI1表达的生物学意义一样。然而，在这个实验系统中，对紫外线由于组蛋白高乙酰化阻止了BMI1和HP1b的明显招募，BMI1和HP1b的-受损染色质可能依赖于乙酰化事件紫外线-受损染色质(图1和图2)。使用独立的实验方法，并结合使用紫外线激光(355 nm)和激光线连接到徕卡TCS在sp5x共聚焦显微镜下，我们发现了乙酰化状态对DNA修复过程的重要性。因此，我们的结果有助于理解特定组蛋白标记如何影响DNA修复相关事件。这个简短报告中的数据由Šustáčková等人发表。[8]。
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