溶解的钙和磷,还有当前水方法排除了超微结构分析初始水泡在生物矿化事件吗?
以前的工作提出了软骨和/或骨矿化利用单个泡人口丰富的钙和磷,或者,两个泡数量分别富含钙和磷(图1)(安德森,1967;Bonucci, 1967;阿瑟罗和Ottensmeyer, 1984)。为了澄清这个问题,这些离子的溶解度需要使用其他方法,如高压冷冻和冷冻置换,以避免损失在标本固定、包埋、切片。因为大多数之前的研究没有一直在样品处理过程中避免了水,伪非水处理的真正影响osteoblast-mediated矿化的过程是难以评估。
我们的研究的目的是使用同步UMR106-01文化模型设计和验证一个伪非水处理方法图像中钙和磷离子的分布BMF立即fi rst羟磷灰石晶体的成核前在其中(图1)。我们认为这种方法也应该适用于调查的时间变化等其他细胞的钙离子分布肌肉。
图1:单一和双泡细胞外矿化的模型。上面板,单一矩阵泡模型。钙和磷离子逐渐集中在单一基质小泡人口通过Ca的建议行动+ 2天然气腺苷三磷酸酶,Na+磷酸co-transporter,磷酸酶作用于磷脂。一旦Ca+ 2和磷酸盐离子浓度达到一个阈值(黄色),最初的矿物晶体的成核发生导致破损的囊泡和释放晶体可以传播更多的在周围的细胞外胶原基质晶体。较低的面板,双泡模型。钙和磷逐渐集中在两个不同人群的囊泡显示不同的生化反应功能分布包括Ca+ 2泵atp酶和Na+磷酸co-transporter活动,分别。随后,这些钙和磷酸盐丰富泡人口融合和成核矿物晶体导致破损的囊泡和释放晶体可以传播更多的在周围的细胞外胶原基质晶体。
钙和磷丢失从高压冷冻,freeze-substituted或传统固定样本
使用高压冷冻和freeze-substitution不足以保持不稳定的钙和磷的矿化成骨细胞的细胞培养
钙和磷可以从样本失去高压冷冻和freeze-substitution之后或在传统的固定。评估我们的伪非水方法的有效性,我们选择停止文化在76 h,十二小时后添加磷酸ß-glycerol矿化刺激,但2 h的外观在BMF第一晶体矿物(Midura et al ., 2004;王et al ., 2009)。一些文化中被随机选择要处理常规固定(图2),而另一些被高压冷冻加工(徕卡新兴市场协议)和freeze-substitution(图3)。比较这些成对文化支持几个结论。大面积包含一个比较均匀的颗粒有机基体后传统的固定。这些区域似乎排除膜囊泡的有限体积。相比之下,高压冷冻文化包含许多几乎“白色”细胞外区域,内直径大约0.5 - 1μm, BMF(箭头,图3)。
在更高权力的观点,很明显,尽管这些“白色”低对比度区域拥有一个底层细节代表一系列形状不规则的球形身体直径约50至800纳米(没有显示)。然而,这些“白色”的存在地区立即提出关于无机或有机物质损失的担忧。特别是,从配对与类似的BMF地区相比,传统固定文化(图2),我们假设“白色”点代表材料由高压冷冻优先保留,但随后失去了进一步处理。
钙和磷提高保留在干燥的分段高压冷冻,freeze-substituted文化
并排比较显示干切片结合高压冷冻和freeze-substitution需要观察细胞外泡数量丰富的钙和磷在矿化成骨细胞的文化
值得注意的是,随后的电子光谱成像的钙和磷是不可能在传统固定或freeze-substituted当时被切割的样品水无论标本post-stained与否(结果未显示)。因此我们代替干湿切片高压冷冻切片,冷冻取代文化。钙和磷提高保留在干燥的分段高压冷冻,freeze-substituted文化。很明显,替代干切片导致显著增加保留内钙和磷的生物矿化焦点(比较图3(湿切片)和4(干切片)]。
焦点直径0.5 - 1μm领域出现的“白色”点在图3中湿切片后,现在看来黑暗(图4)零损失能量的形象。这一事实UMR106-01文化采集矿物可再生的,暂时的同步方式促进这些直接比较不同的文化(王et al ., 2009)。此外,电子光谱成像表明,黑暗中出现地区富含钙和磷(比较图4 a、B和C)。最后,如覆盖图像如图4所示,钙磷(红色)和(绿色)信号在76 h文化很大程度上是互相重叠的黄色显示。因为其他的研究表明,76 h UMR106-01文化不包含检测矿物晶体(霍夫曼et al ., 2007;王et al ., 2009),钙和磷的丰富内容观察这里可能是无定形磷酸钙(Driessens et al ., 1978)和/或不稳定的有机形式的磷等聚磷酸盐(Omelon et al ., 2009)。
重要的是,观察到丰富的功能性角色焦点内容支持钙和磷的矿化分析un-mineralized控制文化。当类似的高压冻结,冻结替换,和干切片方法应用于un-mineralized UMR106-01文化,一些暗(钙和/或磷富集)囊泡或粒子被发现(没有显示)。最后,一个额外的优势振动刀的使用是减少压缩在切片和减少皱纹的合成部分。
总结
总之,我们的结果表明,高压冷冻和伪非水处理需要及早发现细胞外的钙和磷富集在矿化成骨细胞的文化。使用干切片被证明是一个关键的步骤,钙和磷的保护。同时,电子光谱成像表明,黑暗彩色泡胞外生物矿化疫源地内富含钙和磷检测之前水晶矿物(王et al ., 2009)。我们现在计划使用这种方法来确定成骨细胞的细胞在体外和体内利用单个或双泡成矿机制(Gorski et al ., 2004;Midura et al ., 2009)。
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